Kronisk salmonella infektion induceret tarm fibrose

Summary

Denne protokol beskriver en musemodel af salmonella drevet tarm fibrose, der ligner de vigtigste patologiske kendetegn af Crohns sygdom, herunder transmural inflammation og fibrose. Denne metode kan bruges til at evaluere værts faktorer, der ændrer fibrotiske udfald ved hjælp af muterede mus, som vedligeholdes på en C57Bl/6 genetisk baggrund.

Abstract

Vævs fibrose karakteriseret ved den patologiske ophobning af ekstracellulære matrix såsom kollagen er resultatet af vedvarende inflammation og dysreguleret reparation. I inflammatorisk tarmsygdom (IBD), fibrose fører til recidiverende striktur formationer, som der ikke er nogen effektiv behandling andre end kirurgisk resektion. På grund af sin sene debut, de processer, der drev fibrose er mindre undersøgt og stort set ukendt. Derfor udgør fibrotiske komplikationer en stor udfordring i IBD. I denne protokol beskrives en robust in vivo-model af intestinal fibrose, hvor streptomycin forbehandling af C57Bl/6-mus efterfulgt af oral sonde med vaccine kvalitet salmonella typhimurium ΔAroA mutant fører til vedvarende patogen kolonisering og fibrose af cecum. Metoder til udarbejdelse af S. Typhimurium ΔAroA for inokulation, kvantificere patogenet belastninger i cecum og milt, og evaluere kollagen deposition i tarm væv forklares. Denne eksperimentelle sygdomsmodel er nyttig til at undersøge værts faktorer, der enten forbedrer eller forværrer CD-lignende tarm fibrose.

Introduction

Ulcerativ colitis (UC) og Crohns sygdom (CD) er de to vigtigste former for IBD og er karakteriseret som kroniske og recidiverende inflammatoriske lidelser i mave-tarmkanalen ^1,2. Disse lidelser har stor indflydelse på patienternes livskvalitet. Symptomerne på IBD omfatter abdominalsmerter, diarré, kvalme, vægttab, feber, og træthed³. Nylige undersøgelser har identificeret genetiske og miljømæssige faktorer, der bidrager til sygdoms patogenese; Det menes, at sådanne risikofaktorer bidrager til forstyrrelsen af epitelial barrieren, hvilket resulterer i translokation eller oversampling af luminale antigener⁴. Som en konsekvens, dette indleder en afvigende inflammatorisk reaktion på den kommensal flora medieret af tarm immunceller⁴. Funktioner af IBD-associerede komplikationer kan strække sig til steder ud over mave-tarmkanalen påvirker forskellige organer, herunder leddene, hud, og leveren^1,2. Kendetegn for UC omfatter svær og diffus inflammation typisk lokaliseret i tyktarmen¹. Sygdoms patologi påvirker slimhinden og submucosa i tarmen, hvilket resulterer i overfladiske slimhinde ulcerationer¹. I modsætning, CD kan påvirke nogen del af mave-tarmkanalen selvom tegn på sygdom er almindeligt forekommende i tyktarmen og distale ileum². Desuden er betændelse i CD transmural, påvirker alle lag af tarmvæggen².

Adskillige IBD-følsomheds gener, der er blevet identificeret, indikerer, at dysregulering af epitelial barrieren eller immuniteten er kritiske bidragydere til sygdomsprogression⁵. Mutationer i nucleotidoligomerisering domæne 2 (NOD2) udtrykt ved monocytter blev fundet at være forbundet med øget følsomhed over for CD; Dette fremhæver en sammenhæng mellem ændret medfødte immun påvisning af bakterie komponenter og sygdommen⁶. Nyere Genome-dækkende Associations studier (GWAS) har afsløret yderligere veje, som potentielt er involveret i IBD’S patogenese, herunder genetiske variationer i: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R afhængige veje knyttet til adaptive immunitet, MUC1, MUC19, og PTGER4 i intestinal barriere vedligeholdelse, og ATG16L-medieret autophagy^7,8,9. Mens disse populations-baserede genetik undersøgelser har forbedret vores forståelse af IBD, modtagelighed alleler alene er sandsynligvis utilstrækkelige i initiering og opretholdelse af kronisk sygdom³. Andre ikke-genetiske faktorer, herunder ændringer i tarm mikrobiom sammensætning og en reduktion i mangfoldighed har været forbundet med tarmbetændelse. Det er imidlertid uklart, om Gut dysbiosis går forud for eller er konsekvensen af dysregulerede immunrespons³. Selvom etiologien af IBD fortsat er uklar, vores forståelse af patogenesen af sygdommen er blevet forstærket af eksperimentelle musemodeller af tarmbetændelse^10,11. Disse modeller individuelt repræsenterer ikke fuldt ud kompleksiteten af den menneskelige sygdom, men de er værdifulde for belyse patofysiologiske veje, der kunne være relevante for IBD og for validering af foreløbig terapeutiske strategier^{10, 11}. Sådanne musemodeller er typisk afhængige af indledning af betændelse ved kemisk induktion eller infektion, immuncelle overførsel eller genetisk manipulation. Desuden omfatter disse strategier ofte forstyrrelser i epitelial integritet eller graduering af medfødte eller adaptive immunitet.

Salmonella enterica d er intestinale patogener, der kan inficere mennesker og mus. Efter indtagelse kan salmonella kolonisere tarmen ved direkte invasion af epithelia, M-celler eller antigen, som præsenterer cellerne¹². Mus inficeret oralt med S. Typhimurium resulterer i koloniseringen primært af systemiske steder som milten og mesenteriske lymfeknuder med relativt lav overflod i mave-tarmkanalen¹². Men, forbehandling af mus med streptomycin øger effektiviteten af salmonella kolonisering af tarmen ved at mindske værten beskyttende virkninger af den normale mikrobiota¹³. Patologiske funktioner i denne model omfatter afbrydelse eller ulceration af epitelial barriere, granulocyt rekruttering, og svær ødem¹³. Alternativt, infektion med vaccine grade S. Typhimurium ΔAroA mutant fører til kronisk kolonisering af cecum og kolon, der fortsætter op til dag 40 efter infektion¹⁴. The S. Typhimurium ΔAroA stamme har en defekt i biosyntesen af aromatiske aminosyrer; Dette gør den mutante stamme avirulent og kan udnyttes som en meget effektiv vaccine¹⁵. Oral infektion i mus fører til en Th1-og Th17-cytokin associeret inflammatorisk respons, omfattende væv Remodeling, og kollagen deposition. Vævs patologi er forbundet med forhøjede niveauer af Pro-fibrotisk faktor som TGF-β1, CTGF, og IGF¹⁴. Transmural fibrotisk ardannelse rapporteret i denne model minder om striktur formationer ofte observeret i IBD. Induktion af fibrose ved salmonella kræver virulens, som er kodet af salmonella patogenicitetsøer (SPI)-1 og 2 ¹². Vigtigere, dette S. Tymphimurium ΔAroA infektion model er et nyttigt system til undersøgelse af fibrotiske reaktioner i mutant mus vedligeholdt på en C57/Bl6 baggrund. Den C57/Bl6 stamme er ekstremt følsom over for S. Typhiumurim SL1344 infektion på grund af en tab-af-funktion mutation i genet kodning den naturlige resistens-associeret makrofag protein (nramp)-1^16,17. Vi har konstateret, at IL-17A og RORα-afhængige medfødte lymfoide celler er vigtige bidragydere til patogenesen i denne model¹⁸.

En stor komplikation af CD er den dysregulerede og overdreven aflejring af ekstracellulære matrix (ECM) herunder kollagen^2,19. Selv om mave-tarmkanalen har en relativ høj kapacitet til regenerering, kan fibrotisk ardannelse opstå på grund af uløste sårheling svar, der er forbundet med kronisk og svær inflammation^20,21. I cd, dette resulterer i skadelige virkninger på væv arkitektur fører til signifikant organ svækkelse^21,22. Den transmural karakter af inflammation observeret i CD i sidste ende går forud for fortykkelse af tarmvæggen forbundet med symptomatisk stenose eller striktur dannelse²¹. Omkring en tredjedel af CD-patienter kræver tarm resektion for denne komplikation²². Der er ingen effektive anti-fibrotiske behandlinger i IBD, da brugen af immunsuppressiva såsom azathioprin eller anti-tnfα biologiske lægemidler ikke har nogen indvirkning eller kun beskedent reducerede kravet om kirurgiske indgreb^19,23 . Mens fibrose menes at være konsekvensen af kronisk inflammation, celler af mesenchymal oprindelse såsom fibroblaster og pericytes menes at være de primære cellulære kilder til ECM i fibrotisk ardannelse^21,24. Kroniske S. Typhimurium ΔAroA infektion er en robust musemodel af tarm fibrose, der kan tilbyde indsigt i patogenesen af CD-lignende funktioner.

Protocol

Alle dyre protokoller blev godkendt af dyresundheds komiteen på University of British Columbia. 1. forberedelse af salmonella typhimurium ΔAroA kulturer for oral sonde af mus Fra en frosset glycerol bestand af S. Typhimurium ΔAroA, Forbered en stribe plade ved hjælp af LB agar indeholdende 100 μg/mL streptomycin med en steril inokulerende løkke. Inkuber natten over ved 37 °C. Stribe pladerne kan opbevares i op til en uge ved 4 °C. En dag før infek…

Representative Results

Behandling med streptomycin efterfulgt af oral infektion med S. Typhimurium ΔAroA fører til robust tarmbetændelse og fibrose især i cecum (figur 1). Typiske patogen byrder på 108 til 109 CFU pr. 1 g cecum og 104 CFU pr. 1 g milt kan inddrives fra inficerede dyr (figur 2). Vurdering af fibrose i picrosirius rødfarvede cecal sektioner indikerer peak fibrose 21 dage efter infektion, mens en stor del af patologien er l…

Discussion

Vores forståelse af patogenesen af IBD er blevet stærkt forstærket af musemodeller af tarmbetændelse. Selv om sådanne individuelle modeller ikke rekapitulerer alle funktioner i den komplekse og multifaktorielle menneskelige sygdom, de har været nyttige i at identificere centrale elementer i sygdomsprogression. Fibrotiske strikturer forbundet med IBD er fortsat et stort uopfyldt klinisk behov, da aktuelle behandlinger er ineffektive til at vende sygdomsudvikling. Desuden er intestinal fibrose svært at studere i et …

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM