Generation af definerede genomiske modifikationer med CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller
Summary
Denne protokol giver en metode til at lette genereringen af definerede heterozygot eller homozygot nukleotid ændringer ved hjælp af CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller.
Abstract
Humane pluripotente stamceller tilbyder et stærkt system til at studere genfunktion og modelspecifikke mutationer, der er relevante for sygdom. Dannelsen af præcise heterozygot genetiske modifikationer er udfordrende på grund af CRISPR-CAS9 medieret Indel dannelse i den anden alleler. Her demonstrerer vi en protokol for at hjælpe med at overvinde dette problem ved at bruge to reparations skabeloner, hvor kun én udtrykker den ønskede sekvens ændring, mens begge skabeloner indeholder tavse mutationer for at forhindre re-skæring og Indel dannelse. Denne metode er mest fordelagtig for genredigering kodning regioner af DNA til at generere isogene kontrol og mutant menneskelige stamceller linjer til at studere sygdomme hos mennesker og biologi. Derudover er optimering af transfektering og screeningmetoder blevet udført for at reducere arbejdskraft og omkostninger ved et genredigerings eksperiment. Samlet set denne protokol er almindeligt gældende for mange genomredigering projekter udnytte den menneskelige pluripotente stamcelle model.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (ipscs) er værdifulde værktøjer til modellering af sygdomme hos mennesker på grund af deres evne til fornyelse, samtidig med at evnen til at generere celletyper af forskellige nedstamningens1,2 ,3,4. Disse modeller åbner mulighed for at afhøre gen funktion, og forstå, hvordan specifikke mutationer og fænotyper er relateret til forskellige sygdomme5,6. Men for at forstå, hvordan en specifik ændring er knyttet til en bestemt fænotype, er brugen af en parret isogene kontrol og mutant cellelinjer vigtigt at kontrollere for linje til linje variation7,8. Transskription aktivator-lignende Effector nucleaser (TALENs) og zink finger nucleaser er blevet brugt til at generere indsættelse eller sletning (indels) mutationer i forskellige genetiske modeller, herunder primære celler; men disse nukleaser kan være besværlige at bruge og dyre9,10,11,12,13,14. Opdagelsen af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske REPEAT (crispr)-CAS9 nuclease har revolutioneret feltet på grund af effektivitet i Indel dannelse i stort set alle områder af genomet, enkelhed i brug, og reduktion i omkostninger15 , 16 , 17 , 18 , 19.
En udfordring i at bruge CRISPR-CAS9 baseret genomredigerings teknologi har været generering eller korrektion af specifikke mutationer i en allel uden at skabe en indelmutation i den anden allel20. Det vigtigste mål med denne protokol er at overvinde denne udfordring ved at bruge to enkelt-strenget oligonucleotid (ssODN) reparations skabeloner til at reducere Indel dannelse i den anden allel. Begge ssODNs er designet til at indeholde tavse mutationer for at forhindre re-skæring af CAS9 nuclease, men kun én indeholder ændringen af interesse. Denne metode øger effektiviteten af at generere en specifik heterozygot genetisk modifikation uden inducerende Indel dannelse i den anden allel. Ved hjælp af denne protokol viser genredigerende eksperimenter på seks uafhængige genomiske steder den præcise indførelse af den ønskede genomiske ændring i en allel uden indels dannelse i den anden allel og forekommer med en samlet effektivitet på ~ 10%. Den beskrevne protokol er blevet tilpasset fra Maguire et al.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol, brugen af CRISPR-CAS9 sammen med to ssODN reparation skabeloner til at generere specifikke heterozygot eller homozygot genom ændringer er påvist i humane pluripotente stamceller. Denne metode resulterede i en vellykket generation af isogene cellelinjer, som udtrykker heterozygot genomiske forandringer med en virkningsgrad tæt på 10%. Denne protokol er blevet optimeret til både humane Esc’er og iPSCs dyrket på bestrålede Mef’er, som understøtter cellevækst og overlevelse efter dyrkning af celler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af midler fra National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), nationale institutter for sundhed gennem Grants U01HL099656 (P.G. og D.L.F.) og U01HL134696 (P.G. og D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
