Detta protokoll ger en metod för att underlätta generering av definierade heterozygot eller homozygot nukleotidförändringar med hjälp av CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller.
Humana pluripotenta stamceller erbjuder ett kraftfullt system för att studera genfunktion och modellspecifika mutationer relevanta för sjukdom. Generationen av exakta heterozygot genetiska modifikationer är utmanande på grund av CRISPR-CAS9 medierad indel formation i den andra allelen. Här demonstrerar vi ett protokoll för att hjälpa till att övervinna denna svårighet genom att använda två reparationsmallar där endast en uttrycker önskad sekvens förändring, medan båda mallarna innehåller tysta mutationer för att förhindra omskärning och indel formation. Denna metod är mest fördelaktig för genredigering kodnings regioner av DNA för att generera ISOGEN kontroll och muterade mänskliga stamcellslinjer för att studera mänskliga sjukdomar och biologi. Dessutom har optimering av transfektion och screeningmetoder utförts för att minska arbete och kostnader för ett genredigering experiment. Sammantaget är detta protokoll allmänt tillämpligt på många genom redigering projekt som utnyttjar den mänskliga pluripotenta stamcells modellen.
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs) är värdefulla verktyg för modellering av mänskliga sjukdomar på grund av deras förmåga till förnyelse, samtidigt som förmågan att generera celltyper av olika härstamningar1,2 ,3,4. Dessa modeller öppnar möjligheten att förhöra genfunktion, och förstå hur specifika mutationer och fenotyper är relaterade till olika sjukdomar5,6. För att förstå hur en specifik förändring är kopplad till en viss fenotyp är dock användningen av en parkopplad ISOGEN kontroll och muterade cellinjer viktig för att kontrollera linje-till-linjevariationen7,8. Transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens) och zink finger nukleaser har använts för att generera insättning eller radering (indels) mutationer i olika genetiska modeller, inklusive primära celler; men dessa nukleaser kan vara besvärligt att använda och dyra9,10,11,12,13,14. Upptäckten av den grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom REPEAT (CRISPR)-CAS9 Nuclease har revolutionerat området på grund av effektivitet i indel formation i praktiskt taget alla regioner i arvsmassan, enkelhet i användning, och minskning av kostnaderna15 , 16 , 17 , 18 , 19.
En utmaning i att använda den CRISPR-CAS9 baserade genom-redigeringsteknik har varit generering eller korrigering av specifika mutationer i en allel utan att skapa en indel-mutation i den andra allelen20. Det stora målet med detta protokoll är att övervinna denna utmaning genom att använda två enkelsträngade oligonukleotid (ssODN) reparationsmallar för att minska indel formation i den andra allelen. Båda ssODNs är utformade för att innehålla tysta mutationer för att förhindra omskärning av CAS9 Nuclease, men bara en innehåller förändringen av intresse. Denna metod ökar effektiviteten av att generera en specifik heterozygot genetisk modifiering utan att inducera indel formation i den andra allelen. Med hjälp av detta protokoll, genredigering experiment i sex oberoende genomisk platser visar exakt införandet av önskad genomisk förändring i en allel utan indel formation i den andra allelen och sker med en totalverkningsgrad på ~ 10%. Det beskrivna protokollet har anpassats från Maguire et al.21.
I detta protokoll, användning av CRISPR-CAS9 tillsammans med två ssODN reparationsmallar för att generera specifika heterozygot eller homozygot genom förändringar påvisas i humana pluripotenta stamceller. Denna metod resulterade i en lyckad generering av isogena cellinjer som uttrycker heterozygot genomiska förändringar med en verkningsgrad nära 10%. Detta protokoll har optimerats för både mänskliga ESCs och iPSCs som odlas på bestrålade MEFs som stöder celltillväxt och överlevnad efter odling av celler …
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av finansiering från National Heart, lung, och blod Institute (NHLBI), National Institutes of Health genom bidrag U01HL099656 (P.G. och D.L.F.) och U01HL134696 (P.G. och D.L.F.).
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
Agarose | VWR | N605 | |
DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
dNTPs | Roche | 11969064001 | |
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
Orbital shaking incubator | |||
pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |