कार्यक्रम योग्य आउटपुट आवृत्ति के साथ एक स्व-निर्मित वाल्ट-एम्पीयरमीटर का उपयोग करते हुए TEER मापन करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण
Summary
यहाँ, हम प्रदर्शित कैसे प्रोग्राम उत्पादन आवृत्ति है कि transepithelial के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड के साथ इस्तेमाल किया जा सकता के साथ एक सस्ती वोल्ट-amperemeter स्थापित करने के लिए /
Abstract
इन विट्रो बैरियर मॉडल सिस्टम के संगम और पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए 1980 के दशक से ट्रांसपेथेलियल/एंडोथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईईआर) का उपयोग किया गया है। ज्यादातर मामलों में, चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड सेलुलर monolayers युक्त एक सेल संस्कृति फिल्टर डालने प्रणाली के ऊपरी और निचले डिब्बे के बीच बिजली प्रतिबाधा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। फिल्टर झिल्ली कोशिकाओं का पालन करने के लिए, polarize, और तंग जंक्शनों के निर्माण के द्वारा बातचीत करने की अनुमति देता है. इस तकनीक को विभिन्न सेल लाइनों की एक किस्म के साथ वर्णित किया गया है (उदा., रक्त मस्तिष्क बाधा की कोशिकाओं, रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा, या जठरांत्र और फुफ्फुसीय पथ). TEER माप उपकरणों को आसानी से विभिन्न प्रयोगशाला उपकरण आपूर्तिकर्ताओं से प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, वहाँ और अधिक लागत प्रभावी और अनुकूलन समाधान कल्पना कर रहे हैं अगर एक उपयुक्त voltammeter स्वयं इकट्ठे है. इस प्रकाशन के समग्र उद्देश्य के लिए वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध chopstick इलेक्ट्रोड के साथ TEER माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रोग्राम उत्पादन आवृत्ति के साथ एक विश्वसनीय डिवाइस स्थापित करने के लिए है.
Introduction
Epithelial और endothelial कोशिकाओं सेलुलर सीमाओं के रूप में कार्य करते हैं, शीर्ष और शरीर के basolateral पक्षों को अलग. यदि वे तंग जंक्शनों के माध्यम से जुड़े हुए हैं, तो कोशिकीय रिक्त स्थान के माध्यम से निष्क्रिय पदार्थ प्रसार प्रतिबंधित है1,जिसके परिणामस्वरूप चुनिंदा पारगम्य बाधा का निर्माण होता है। कई कृत्रिम बाधा प्रणालियों माइक्रोवास्कुलर endothelial कोशिकाओं का उपयोग कर2 विकसित किया गया है (HBMEC, रक्त मस्तिष्क बाधा3,4,5,6,7), choroid जाल एपिथेलियल कोशिकाओं (HIBCPP/PCPEC, रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधा8,9,10,11,12,13,14, कोलोरेक्टल एडेनोकार्सीनोमा कोशिकाओं (कैको-2, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल मॉडल15), या एयरवे/ इन प्रणालियों को आम तौर पर पारगम्य झिल्ली पर एक मोनोलेयर में विकसित कोशिकाओं से मिलकर बनता है (यानी, फिल्टर डालने प्रणाली) शीर्ष और basolateral पक्षों के लिए उपयोग की अनुमति देने के लिए. यह महत्वपूर्ण है कि मॉडल प्रणाली की अखंडता vivo स्थितियों में मेल खाता है. अतः कोशिका स्तर पर अनुरेखक यौगिकों के पराकोशिकीय प्रसार को मापने के द्वारा अवरोध फलन का विश्लेषण करने के लिए अनेक तकनीकें विकसित की गई हैं। इन पदार्थों में रेडियोलेबल सुक्रोज, डाई-लेबल एल्बुमिन, FITC-लेबल इनुलिन, या डाई-लेबल ्डेड डेक्सट्रांस2शामिल हैं। हालांकि, रासायनिक रंगों कोशिकाओं को आगे के प्रयोगों के लिए अनुपयोगी बना सकते हैं. बाधा प्रणालियों की निगरानी करने के लिए गैर आक्रामक, एक सेलुलर मोनोलेयर भर में transepithelial/transendothelial विद्युत प्रतिरोध (टीईईईआर) की माप2,18,19इस्तेमाल किया जा सकता है। क्योंकि द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड सिस्टम इलेक्ट्रोड-इलेक्ट्रोलाइट इंटरफ़ेस पर इलेक्ट्रोड ध्रुवण प्रतिबाधा से प्रभावित होते हैं, टेट्रापोलर माप आम तौर पर इस सीमा को दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है20. underlaying तकनीक एक चार टर्मिनल संवेदन (4T) है कि पहली बार 1861 में विलियम थॉमसन (भगवान केल्विन)21द्वारा वर्णित किया गया है. संक्षेप में, धारा धारा ले जाने इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी द्वारा इंजेक्शन है, जबकि वोल्टेज संवेदन इलेक्ट्रोड की एक दूसरी जोड़ी वोल्टेज ड्रॉप को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है20. आजकल, तथाकथित चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड डबल इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी से मिलकर बनता है, प्रत्येक वोल्टेज कोमापने के लिए एक चांदी / विद्युत प्रतिबाधा को शीर्ष और बासोपार्श् विक डिब्बे के बीच में कोशिका परत के साथ मापा जाता है (चित्र 1)। आम तौर पर की एक आवृत्ति पर एक वर्ग लहर संकेत 12.5 हर्ट्ज बाहरी इलेक्ट्रोड पर लागू किया जाता है और जिसके परिणामस्वरूप बारी वर्तमान (एसी) मापा. इसके अतिरिक्त, सेल परत भर में संभावित ड्रॉप दूसरे (इनर) इलेक्ट्रोड जोड़ी द्वारा मापा जाता है. विद्युत प्रतिबाधा तो ओम के कानून के अनुसार गणना की है. TEER मान प्रतिबाधा और कोशिका परत सतह क्षेत्र गुणा करके सामान्यीकृत होते हैं और आमतौर पर इसे र् ं ब 2के रूप में व्यक्त किया जाता है।
वहाँ प्रणालियों में जो कोशिकाओं और इलेक्ट्रोड एक और अधिक परिष्कृत तरीके से व्यवस्थित कर रहे हैं, लेकिन यह भी 4T मापने के सिद्धांत पर आधारित हैं और एक ही माप उपकरणों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. EndOhm सिस्टम, उदाहरण के लिए, जिसमें फिल्टर डाला जाता है, एक कक्ष और टोपी चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड के रूप में एक ही संरचना के साथ गाढ़ा इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी के साथ होते हैं. इलेक्ट्रोड के आकार झिल्ली भर में एक अधिक समान वर्तमान घनत्व प्रवाह के लिए अनुमति देता है, जिससे रीडिंग के बीच भिन्नता को कम करने. इससे भी अधिक जटिल (लेकिन यह भी अधिक सटीक) एक Ussing कक्ष है, जहां एक सेल परत रिंगर समाधान22से भरा दो कक्षों को अलग करती है. कक्ष ही ऑक्सीजन के साथ gassed किया जा सकता है, सीओ2, या N2, और हलचल या प्रयोगात्मक पदार्थों के साथ पूरक. के रूप में सेल परत भर आयन परिवहन होता है, एक संभावित अंतर ऊतक के पास दो वोल्टेज संवेदन इलेक्ट्रोड द्वारा मापा जा सकता है. इस वोल्टेज को कोशिका स्तर के बगल में रखे दो धारा-वाहक इलेक्ट्रोडों द्वारा रद्द कर दिया जाता है। मापा धारा तो शुद्ध आयन परिवहन दे देंगे और transepithelial प्रतिरोध, जो बाधा अखंडता को दर्शाता है,22निर्धारित किया जा सकता है. TEER माप भी शरीर पर लागू किया जा सकता है एक चिप सिस्टम है कि बाधा ऊतक मॉडल का प्रतिनिधित्व23,24. इन प्रणालियों कोशिकाओं की vivo शर्तों में नकल और अक्सर कोशिकाओं के कई प्रकार से मिलकर बनता है, परतों में एक दूसरे के शीर्ष पर खड़ी.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल बताते हैं कि कैसे प्रोग्राम उत्पादन आवृत्ति है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माप प्रणालियों की तुलना में TEER में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर पैदा करता है के साथ एक लागत प्रभावी और विश्वसनीय voltammeter स्थापित करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
इससे पहले कि एक स्वयं बनाया voltammeter एक दैनिक दिनचर्या में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह उचित समारोह के लिए डिवाइस की जांच करने के लिए आवश्यक है. हमारे मामले में, 40 एमएस (12.5 हर्ट्ज) के दोलन का एक आधा समय क्रमादेशि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को इलेक्ट्रोटेक्निक और सूचना विज्ञान में अपनी विशेषज्ञ सलाह के लिए हरमन Liggesmeyer और मारविन Bende शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
Referências
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