En enkel metod för att utföra TEER mätningar med hjälp av en egentillverkad volt-amperemeter med programmerbara utdata frekvens
Summary
Här visar vi hur man ställer in en billig volt-amperemeter med programmerbara utdata frekvens som kan användas med kommersiellt tillgängliga chopstick elektroder för transepitelial/endoteliala mätningar elektriskt motstånd.
Abstract
Transsepitelial/endothelial elektriskt motstånd (TEER) har använts sedan 1980-talet för att bestämma confluency och permeabilitet av in vitro-barriär modellsystem. I de flesta fall, chopstick elektroder används för att bestämma den elektriska impedansen mellan det övre och undre facket i en cellkultur filter infoga system som innehåller cellulära monolayers. Filtret membranet gör att cellerna att fästa, polarisera, och interagera genom att bygga snäva korsningar. Denna teknik har beskrivits med en mängd olika cellinjer (t. ex. celler i blod-hjärnbarriären, blod-cerebrospinalvätska barriär, eller gastrointestinala och pulmonell tarmkanalen). TEER mätanordningar kan lätt erhållas från olika leverantörer av laboratorieutrustning. Det finns dock mer kostnadseffektiva och anpassningsbara lösningar tänkbara om en lämplig voltammeter är självmonterad. Det övergripande syftet med denna publikation är att ställa in en tillförlitlig enhet med programmerbar utgångsfrekvens som kan användas med kommersiellt tillgängliga chopstick elektroder för TEER mätning.
Introduction
Epitelial och endotelceller fungerar som cellulära gränser, separera apikala och basolaterala sidor av kroppen. Om de är anslutna genom täta korsningar, passiv substans diffusion genom paracellulära utrymmen är begränsad1, vilket resulterar i bildandet av en selektivt permeabel barriär. Flera konstgjorda barriär system har utvecklats2 använda mikrovaskulära endotelceller (hbmec, blod-hjärnbarriären3,4,5,6,7), plexus koroidea epitelceller (hibcpp/pcpec, blod-cerebrospinalvätska barriär8,9,10,11,12,13,14), adenocarcinom i kolorektal (Caco-2, gastrointestinala modeller15), eller luftvägarna/alveolära cellinjer (pulmonella modeller16,17). Dessa system består vanligtvis av celler som odlas i en enskiktslager på permeabla membran (dvs., filter infoga system) för att ge tillgång till den apikala och basolaterala sidor. Det är viktigt att modell systemets integritet överensstämmer med in vivo-villkoren. Därför har flera tekniker utvecklats för att analysera barriärfunktion genom att mäta paracellulär diffusion av spårämnen över cell skiktet. Dessa ämnen inkluderar radiomärkt sackaros, Dye-märkt albumin, FITC-märkta inulin, eller Dye-märkt dextrans2. Men kemiska färgämnen kan göra celler oanvändbara för ytterligare experiment. För att övervaka barriär system noninvasively, mätning av transepitelial/transendothelial elektriskt motstånd (TEER) över en cellulär enskiktslager kan användas2,18,19. Eftersom bipolär elektrod system påverkas av elektroden polarisering impedansen vid elektrod-elektrolyt gränssnitt, tetrapolära mätningar används i allmänhet för att övervinna denna begränsning20. Den underutnings teknik är en fyra-terminal avkänning (4T) som först beskrevs i 1861 av William Thomson (Lord Kelvin)21. I korthet injiceras strömmen av ett par strömbärande elektroder medan ett andra par spännings Avkännings elektroder används för att mäta spänningsfallet20. Numera, så kallade chopstick elektroder består av ett par dubbla elektroder, vardera innehåller en Silver/Silver-klorid pellet för mätning av spänning och en silver elektrod för att passera nuvarande2. Den elektriska impedansen mäts mellan det apikala och det basolaterala facket med cell skiktet däremellan (figur 1). En fyrkantig vågsignal med en frekvens av typiskt 12,5 Hz appliceras på de yttre elektroderna och den resulterande växelströmmen (AC) mätt. Dessutom mäts potentiell droppe över cell skiktet med det andra (inre) elektrod paret. Elektrisk impedans beräknas sedan enligt Ohms lag. TEER värden normaliseras genom att multiplicera impedans och cell lager yta och uttrycks vanligen som Ω ∙ cm2.
Det finns system där celler och elektroder är ordnade på ett mer sofistikerat sätt, men är också baserade på 4T-mätprincipen och kan användas med samma mätutrustning. EndOhm system, till exempel, där filtret är insatt, innehåller en kammare och mössa med ett par koncentriska elektroder med samma struktur som chopstick elektroden. Elektrodernas form möjliggör en jämnare strömtäthet över membranet, vilket minskar variationen mellan avläsningarna. Ännu mer komplex (men också mer exakt) är en Ussing kammare, där ett cellskikt separerar två kammare fyllda med Ringers lösning22. Kammaren själv kan gasas med syre, CO2, eller N2, och rörs eller kompletteras med experimentella substanser. Eftersom jontransporten över cell skiktet sker kan en potentiell skillnad mätas med två spännings Avkännings elektroder nära vävnaden. Denna spänning avbryts av två strömbärande elektroder placerade bredvid cell skiktet. Den uppmätta strömmen kommer då att ge netto jontransporten och transepitelial resistens, som återspeglar barriär integritet, kan bestämmas22. TEER mätning kan också appliceras på Body-on-a-chip system som representerar barriär-vävnadsmodeller23,24. Dessa system efterliknar in vivo förhållanden i cellerna och består ofta av flera typer av celler, staplade ovanpå varandra i lager.
Följande protokoll förklarar hur man ställer in en kostnadseffektiv och tillförlitlig voltameter med programmerbar utgångsfrekvens som inte ger några statistiskt signifikanta skillnader i TEER jämfört med kommersiellt tillgängliga mätsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Innan en egentillverkad voltammeter kan användas i en daglig rutin, är det viktigt att kontrolleraenheten för korrekt funktion. I vårt fall, en halvtid av svängning av 40 MS (12,5 Hz) programmerades, men den effektiva svängning tiden visade sig vara 60 ms (16,7 Hz). Denna felaktigheter i MicroController ‘ s Time EMITTER hade ingen detekterbar inverkan på TEER mätningar. Det kan vara bäst att bestämma den faktiska frekvensen med hjälp av frekvensinställningen för en av multimetrarna. Om någon avvikelse hitta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Herman Liggesmeyer och Marvin Bende för deras expertråd inom elektroteknik och informatik.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
Referências
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
- Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).
