小鼠肝细胞核球状估计的高通量原位方法
Summary
我们提出了一种稳健、经济、灵活的方法，用于测量固定/冷冻组织样本中肝细胞数和核球菌的变化，而不需要流动细胞测量。我们的方法提供了肝细胞学的强大样本范围特征，非常适合跟踪肝损伤和疾病的进展。
Abstract
当肝脏受伤时，肝细胞数量减少，而细胞大小、核大小和脂肪增加。非乳腺细胞的膨胀，如胆囊细胞、肌瘤细胞、祖细胞和炎症细胞也表明慢性肝损伤、组织重塑和疾病进展。在此协议中，我们描述了一种简单的高通量方法，用于计算与损伤、慢性疾病和癌症相关的肝脏细胞组成的变化。我们展示了如何利用从二维（2D）组织部分提取的信息来量化和校准样品内的肝细胞核球，并使用户能够在原位定位肝脏内的特定多西子。我们的方法需要获得固定/冷冻肝材料、基本免疫细胞化学试剂和任何标准的高含量成像平台。它是标准流细胞学技术的有力替代品，需要破坏新收集的组织、空间信息丢失和潜在的分解偏差。
Introduction
哺乳动物肝脏中的肝细胞可以经历停滞的细胞因子细胞生成双核细胞，DNA内复制产生多倍体核，含量高达16N的DNA含量。产后发育、衰老和应对各种细胞压力时，细胞和核障碍总体增加1。多倍化过程是动态的和可逆的2，尽管它的精确生物功能仍不清楚。增加的普洛伊与增殖能力降低4、遗传多样性2、适应慢性损伤5和癌症保护6有关。肝细胞性改变发生由于昼夜节律改变7，并律下8。最值得注意的是，肝脏的脂肪轮廓因损伤和疾病9而改变，令人信服的证据表明，特定的蛋白核变化，如增加+8N核或2N肝细胞的丧失，为跟踪非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）进展3，10，10或病毒感染的差分影响11提供了有用的签名。3
一般来说，肝损伤和再生与肝细胞细胞大小和核面积增加有关，同时肝细胞总数减少，特别是那些具有2NDNA含量10，11,11的肝细胞。肝脏中的帕伦奇马尔损伤也经常伴有非泛状细胞（NPCs）的扩增，包括基质肌纤维细胞、炎症细胞和二能肝祖细胞。高通量方法，提供肝细胞数和核球的定量细胞学概况，同时也考虑到NPC的变化，因此具有相当大的潜力，作为研究和临床工具，以跟踪肝脏在损伤和疾病期间的反应。最近对肝细胞癌人体样本中的普西迪光谱进行实地分析也表明，核球在肿瘤内急剧增加，在更具攻击性的肿瘤亚型中特别扩增，减少分化和TP53 13的损耗。因此，在核策略定量评估方面的方法学进步很可能有助于今后对肝癌的预后分析。
本协议介绍了一种灵活的高通量方法，用于对小鼠肝组织部分进行比较分析，它提供了肝细胞数的详细细胞分析、NPC响应和用于估计核高倍的内部校准方法（图1）。肝细胞在核尺寸和核测量表之前，通过肝细胞核因子4α（HNF4+）免疫标签与NPC区别开来。”最小DNA含量”通过将平均Hoechst 33342强度（DNA密度的代理）与插值的三维（3D）核体积集成，估计为所有圆形核掩膜”最低DNA含量”。然后，使用NPC校准肝细胞最小DNA含量，以生成核球状轮廓。
使用高含量成像进行图像采集、核分割和图像分析，使包含数万个细胞的大面积二维（2D）肝部分进行筛选。提供一个定制程序，用于自动处理高含量图像分析数据，以生成所有圆形肝细胞核的样本范围的ploidy轮廓。这是使用免费下载软件，计算基于立体图像分析（SIA）10，11，14，15的核策略。10,11,14,15SIA方法以前曾被流细胞测定证实为一种准确（尽管费力）的方法，用于估计肝脏14中的肝细胞核糖核，假设循环核形态和核大小与DNA含量之间的单调关系。在本议定书中，这两个核参数都是通过核测量和Hoechst 33342标签的评估来衡量的。计算每个核掩膜的”最小DNA含量”后，使用NPC校准肝细胞核糖核糖，这些NPC具有已知的2-4NDNA含量，因此作为有用的内部控制。
与传统的流细胞测量方法16相比，所述方法使肝细胞核球菌能够就地评估，并且不需要获得新的组织或分解方法，这些方法可能会偏袒结果，难以标准化。与所有基于 SIA 的方法一样，由于赤道平面外较大核的切片，2D 采样对核策略子类 >2N 的代表性不足。全组织蛋白体剖面还描述了所有圆形肝细胞核掩码的最低DNA含量，并且不直接区分单核肝细胞和具有同一双核核核的两个离散（”不接触”）核。然而，这项议定书的简单性使得可以相当的余地加以调整，以考虑到核间隔或细胞周界分析等其他参数，这将有助于识别双核细胞，从而更详细地评估细胞结构。
Protocol
Representative Results
Discussion
介绍了一种高含量、高通量的方法，用于分析毛毛肝中肝细胞核细胞核球的组织重塑和估计。熟悉该过程后，用户可以在 3-5 天内处理、成像和分析多个样本，生成大型可测试数据集，从而提供肝脏健康的详细签名。鉴于样品制备方法的简单性，以及分析的大量细胞和组织区域（平均14 mm2/样本），结果非常可靠，具有很高的可重复性。图像捕获和分析的自动化还可以消除这些重要步骤中?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由西班牙MINECO政府赠款BFU2014-58686-P（LAN）和SAF-2017-84708-R（DJB）资助。LAN得到全国MINECO Ramón和Cajal奖学金RYC-2012-11700和计划GenT奖（瓦伦西亚大学，CDEI-05/20-C）和FMN的支持，由瓦伦西亚将军ACIF/2016/020的区域ValI+D学生。RP要感谢EwaK.Paluch教授的资助。我们感谢艾丽西亚·马丁内斯-罗梅罗博士（CIPF细胞测量服务）对IN细胞分析仪平台的帮助。
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referências
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