A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice
Summary
Wir präsentieren eine robuste, kostengünstige und flexible Methode zur Messung von Veränderungen der Hepatozytenzahl und der Kernploidie in festen/kryokonservierten Gewebeproben, die keine Durchflusszytometrie erfordern. Unser Ansatz bietet eine leistungsstarke probenweite Signatur der Leberzytologie, ideal für die Verfolgung des Fortschreitens von Leberverletzungen und Krankheiten.
Abstract
Wenn die Leber verletzt ist, hepatozyten Zahlen abnehmen, während Zellgröße, Kerngröße und Ploidy zu erhöhen. Die Ausdehnung von nicht-parenchymalen Zellen wie Cholangiozyten, Myofibroblasten, Vorläufern und Entzündungszellen weist auch auf chronische Leberschäden, Gewebeumbau und Krankheitsprogression hin. In diesem Protokoll beschreiben wir einen einfachen Ansatz mit hohem Durchsatz zur Berechnung von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der Leber, die mit Verletzungen, chronischen Krankheiten und Krebs verbunden sind. Wir zeigen, wie Informationen aus zweidimensionalen (2D) Gewebeabschnitten verwendet werden können, um hepatozyte Kernploidie innerhalb einer Probe zu quantifizieren und zu kalibrieren und es dem Benutzer zu ermöglichen, bestimmte Ploidie-Teilmengen innerhalb der Leber in situ zu lokalisieren. Unsere Methode erfordert Zugang zu festem/gefrorenem Lebermaterial, grundlegenden immunzytochemischen Reagenzien und jeder Standardplattform für bildende Bildgebungsmittel mit hohem Inhalt. Es dient als leistungsstarke Alternative zu Standard-Flow-Zytometrie-Techniken, die Eine Unterbrechung des frisch gesammelten Gewebes, Verlust räumlicher Informationen und potenzielle Disaggregationsverzerrung erfordern.
Introduction
Hepatozyten in der Säugetierleber können einer stockenden Zytokinese unterzogen werden, um binukleare Zellen zu produzieren, und DNA-Endoreplikation, um polyploide Kerne zu produzieren, die bis zu 16N DNA-Gehalt enthalten. Insgesamt zelluläre und nukleare Ploidie erhöhen während der postnatalen Entwicklung, Alterung und als Reaktion auf verschiedene zelluläre Belastungen1. Der Prozess der Polyploidisierung ist dynamisch und reversibel2, obwohl seine genaue biologische Funktion unklar bleibt3. Erhöhte Ploidie ist verbunden mit reduzierter Proliferativfähigkeit4, genetische Vielfalt2, Anpassung an chronische Verletzungen5 und Krebsschutz6. Hepatozytenploidie Veränderungen treten als Folge von veränderten zirkadianen Rhythmus7, und Entwöhnung8. Vor allem wird das Ploidy-Profil der Leber durch Verletzung und Krankheitverändert 9, und überzeugende Beweise deuten darauf hin, dass spezifische Ploidy-Änderungen, wie erhöhte 8N-Kerne oder Verlust von 2N Hepatozyten, nützliche Signaturen für die Verfolgung der nicht-alkoholischen Fettleber -Progression (NAFLD) Progression3,10oder die differentialen Auswirkungen von Virusinfektionen11.
Im Allgemeinen sind Leberverletzung und Regeneration mit erhöhter Hepatozytenzellgröße und Kernfläche12verbunden, zusammen mit einer reduzierten Gesamtzahl von Hepatozyten, insbesondere solchen mit 2N-DNA-Gehalt10,11. Parenchymale Verletzungen in der Leber gehen häufig auch mit einer Ausdehnung nicht-parenchymaler Zellen (NPCs) einher, einschließlich stromaler Myofibroblasten, Entzünderzellen und bipotenten Lebervorläuferzellen. Hochdurchsatzmethoden, die ein quantitatives zytologisches Profil der parenchymalen Zellzahl und der Kernploidie liefern und gleichzeitig Veränderungen der NPCs berücksichtigen, haben daher ein beträchtliches Potenzial als Forschungs- und klinische Instrumente, um das Reaktionsverhalten der Leber während von Verletzungen und Krankheiten zu verfolgen. Überzeugende jüngste In-situ-Analysen von Ploidy-Spektren in menschlichen Proben des hepatozellulären Karzinoms zeigen auch, dass die Kernploidie innerhalb von Tumoren dramatisch erhöht ist und speziell in aggressiveren Tumorsubtypen mit reduzierter Differenzierung und Verlust von TP5313verstärkt wird. Daher besteht die große Möglichkeit, dass methodische Fortschritte bei der quantitativen Bewertung der Kernploidie bei der zukünftigen prognostischen Profilierung von Leberkrebs helfen werden.
In diesem Protokoll wird eine flexible Hochdurchsatzmethodik für die vergleichende Analyse von Lebergewebeabschnitten von Mäusen beschrieben, die eine detaillierte zytometrische Profilierung von Hepatozytenzahlen, die NPC-Antwort und eine intern kalibrierte Methode zur Schätzung der Kernploidie bietet (Abbildung 1). Hepatozyten unterscheiden sich von NPCs durch Hepatozyten-Atomfaktor 4 alpha (HNF4) Immunlabelling, vor der Charakterisierung der nuklearen Größe und der nuklearen Morphometrie. Der “Minimale DNA-Gehalt” wird für alle kreisförmigen Kernmasken geschätzt, indem die mittlere Hoechst 33342-Intensität (ein Proxy für DNA-Dichte) mit interpoliertem dreidimensionalem (3D) Kernvolumen integriert wird. Hepatozyten minimaler DNA-Gehalt wird dann mit NPCs kalibriert, um ein nukleares Ploidy-Profil zu erzeugen.
Die Bildaufnahme, die nukleare Segmentierung und die Bildanalyse werden mittels hochauflösender Bildgebung durchgeführt, sodass große Bereiche zweidimensionaler (2D) Leberabschnitte mit Zehntausenden von Zellen gescreent werden können. Für die automatisierte Nachbearbeitung von Bildanalysedaten mit hohem Inhalt wird ein kundenspezifisches Programm bereitgestellt, um ein stichprobenweites Ploidy-Profil für alle kreisförmigen Hepatozytenkerne zu erstellen. Dies wird mit kostenlosen Software zum Herunterladen von Software durchgeführt, um kerntechnische Ploidie basierend auf stereologischer Bildanalyse (SIA)10,11,14,15zu berechnen. Die SIA-Methodik wurde zuvor durch Diedurchflusszytometrie als eine genaue, wenn auch mühsame Methode zur Schätzung der Hepatozyten-Kernploidie in der Leber14validiert, wobei die zirkuläre Kernmorphologie und eine monotone Beziehung zwischen nuklearer Größe und DNA-Gehalt vorausgesetzt werden. In diesem Protokoll werden beide nuklearen Parameter durch Diebewertung der nuklearen Morphometrie und der Hoechst 33342-Kennzeichnung gemessen. Auf die Berechnung des “minimalen DNA-Gehalts” für jede Kernmaske folgt die Kalibrierung der Hepatozyten-Kernploidie mit NPCs, die einen bekannten 2-4N-DNA-Gehalt aufweisen und daher als nützliche interne Kontrolle dienen.
Im Vergleich zu herkömmlichen Durchflusszytometriemethoden16 ermöglicht der beschriebene Ansatz die Bewertung der Hepatozyten-Kernploidie vor Ort und erfordert keinen Zugang zu frischem Gewebe oder Disaggregationsmethoden, die die Ergebnisse verzerrt und schwer zu standardisieren sind. Wie bei allen SIA-basierten Ansätzen sind die Kernploidie-Unterklassen >2N durch 2D-Probenahme aufgrund der Schnittung größerer Kerne außerhalb der äquatorialen Ebene unterrepräsentiert. Das gewebeweite Ploidy-Profil beschreibt auch den minimalen DNA-Gehalt für alle kreisförmigen Hepatozyten-Kernmasken und unterscheidet nicht direkt zwischen mononukleären Hepatozyten und binukleären Zellen, die zwei diskrete (“nicht berührende”) Kerne derselben Ploidie haben. Die Einfachheit dieses Protokolls lässt jedoch einen beträchtlichen Spielraum für eine Anpassung an zusätzliche Parameter wie den internuklearen Abstand oder die Zellperimeteranalyse, die die Identifizierung binuklearer Zellen erleichtern würde, was eine detailliertere Bewertung der zellulären Ploidie ermöglichen würde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein hochgehaltiger, hochdurchsatzhoher Ansatz für die Analyse der Gewebeumgestaltung und Schätzung der Hepatozyten-Atomploidie in der murinen Leber wird beschrieben. Sobald ein Benutzer mit dem Verfahren vertraut ist, kann er mehrere Proben in einem Zeitraum von 3 bis 5 Tagen verarbeiten, abbilden und analysieren, wodurch große testbare Datasets generiert werden, die eine detaillierte Signatur des Leberzustands bereitstellen. Angesichts der Einfachheit der Probenvorbereitungsmethode, zusammen mit der großen Anzahl de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der spanischen MINECO Regierung Zuschüsse BFU2014-58686-P (LAN) und SAF-2017-84708-R (DJB) finanziert. LAN wurde unterstützt durch ein nationales MINECO Ramon y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 und Plan GenT Award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) und FMN von einem regionalen ValI+D Studentenschaft der Valencianischen Generalitat ACIF/2016/020. Das RP würdigt Prof. Ewa K. Paluch für die Finanzierung. Wir danken Dr. Alicia Martinez-Romero (CIPF Cytometry Service) für die Hilfe bei der IN Cell Analyzer Plattform.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referências
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
