תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים
Summary
אנו מציגים שיטה חזקה, חסכונית, וגמיש למדידת שינויים במספר hepatocyte ובכלי הנשק הגרעיני בתוך קבוע/הקפאה דגימות רקמות שאינו דורש זרימה cy, try. הגישה שלנו מספקת חתימה רבת עוצמה לדוגמה של ציטולוגיה בכבד עבור מעקב אחר ההתקדמות של פגיעה בכבד ומחלות.
Abstract
כאשר הכבד נפצע, מספרי הפטוציט מפחיתים, בעוד שגודל התאים, גודל הגרעין והעלייה בפלויידי. התרחבות של תאים שאינם מסוג מדומה, כגון המרה, מיופיברוציטים, ושלתי ותאים דלקתיים גם מצביעים על נזק כבד כרוני, שיפוץ רקמות והתקדמות המחלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה פשוטה תפוקה גבוהה לחישוב שינויים בהרכב הסלולר של הכבד הקשורים לפציעה, מחלה כרונית וסרטן. אנו מראים כיצד מידע שהופק מסעיפים דו ממדיים (2D) רקמות ניתן להשתמש כדי לכמת ולכייל hepatocyte הגרעין הגרעיני בתוך מדגם ולאפשר למשתמש לאתר תת ערכות מסוימות פלואידיות בתוך הכבד באתרו. השיטה שלנו דורשת גישה לחומר כבד קבוע/קפוא, ריאגנטים חיסונית בסיסי וכלי כל פלטפורמת הדמיה גבוהה. היא משמשת חלופה רבת עוצמה לטכניקות הזרימה הסטנדרטיות של cy, אשר דורשות הפרעה של רקמה שנאספה לפני כן, אובדן מידע מרחבי והטיה פוטנציאלית לפירוק.
Introduction
הפטציטים בכבד היונקים יכולים לעבור נתקע ציטוקינזה כדי לייצר תאים binuclear, ו-DNA endoreplication לייצר גרעיני פוליפואיד המכילים עד 16N ה-DNA תוכן. הגדלת הפלואידיות התאית והגרעינית במהלך פיתוח הפוסט-לידה, הזדקנות ותגובה ללחצים סלולריים מגוונים1. תהליך הפוליפולואידיזציה הוא דינמי והפיך2, למרות שתפקידה הביולוגי המדויק אינו ברור3. מוגברת פלויידי הוא קשור עם קיבולת ההתרבות מופחתת4, מגוון גנטי2, הסתגלות לפציעה כרונית5 הגנה מפני סרטן6. השינוי הפטוציט הפלואידי מתרחש כתוצאה מקצב מעגלי משתנה7, והגמילהמשמונה. בעיקר, הפרופיל הפלואידי של הכבד משתנה על ידי פציעה ומחלה9, וראיות משכנעות מציע כי שינויים מסוימים פלואידיות, כגון הגדלת ≥ 8n גרעינים או אובדן של 2n hepatocytes, לספק חתימות שימושיות עבור מעקב אחר מחלת כבד שומני לא אלכוהוליים (nafld11) התקדמות3,10, או ה
במונחים כלליים, פגיעה בכבד והתחדשות קשורים עם גודל תא hepatocyte מוגבר שטח גרעיני12, יחד עם מספר כולל מופחת של hepatocyte, במיוחד אלה עם 2n תוכן DNA10,11. הפציעה בכבד מלווה גם לעתים קרובות על ידי התרחבות של תאים שאינם מתוך הכתוניים (NPCs), כולל סטרומה מיוסטרותקיעות, תאים דלקתיים ותאים מחולל בכבד biפוטנטי. שיטות תפוקה גבוהה המספקות פרופיל ציטולוגי כמותי של מספר תא מדומה ופלויידי גרעיני, ואילו גם חשבונאות לשינויים NPCs, ולכן יש פוטנציאל ניכר כמו מחקר כלים קליניים כדי לעקוב אחר תגובת הכבד במהלך הפציעה והמחלה. משכנעת לאחרונה בניתוח באתרו של הפלויידי ספקטרום בדגימות האדם של קרצינומה hepatocellular גם להדגים כי הפיידי הגרעינית הוא גדל באופן דרמטי בתוך גידולים והוא מוגבר במיוחד תת הגידול אגרסיבי יותר עם בידול מופחת ואובדן של TP5313. מכאן, קיימת אפשרות חזקה שהתקדמות מתודולוגיים בהערכה כמותית של הפלואידיות הגרעינית תסייע ביצירת פרופיל התחזיות העתידיות של סרטן הכבד.
בפרוטוקול זה, מתודולוגיה גמישה בתפוקה גבוהה עבור ניתוח השוואתי של מקטעי רקמת הכבד של העכבר מתוארים, אשר מספק פרופיל cy, מפורט של מספרי hepatocyte, התגובה NPC ושיטה מכויל פנימי להערכת הגרעין פלויידי (איור 1). הפטציטים נבדלים מ NPCs על ידי הגורם הגרעיני hepatocytes 4 אלפא (HNF4α) אימונויניום, לפני אפיון של גודל גרעיני וממורמטריה גרעינית. “תוכן ה-DNA מינימלי” מוערך עבור כל מסכות גרעיניות מעגלית על ידי שילוב ממוצע Hoechst 33342 עוצמה (proxy עבור צפיפות DNA) עם הנפח תלת מימדי (3D) הגרעיני. הפטציט תוכן די-אן-איי מינימלי מכויל לאחר מכן באמצעות NPCs כדי ליצור פרופיל של פלויידי גרעיני.
רכישת תמונה, פילוח גרעיני וניתוח תמונה מבוצעים באמצעות הדמיה בעלת תוכן גבוה, המאפשר אזורים גדולים של דו מימדי (2D) מקטעי כבד המכילים עשרות אלפי תאים להיות מוקרן. תוכנית מותאמת אישית מסופקת לצורך עיבוד אוטומטי של נתוני ניתוח תמונה באיכות גבוהה כדי להפיק פרופיל פלואידי רחב לדגימה לכל גרעין הפטוציט המעגלי. פעולה זו מבוצעת באמצעות חינם כדי להוריד את התוכנה כדי לחשב את הנשק הגרעיני מבוסס על ניתוח התמונה סטריאוולוגית (SIA)10,11,14,15. מתודולוגיית ה-SIA אומתה בעבר על ידי הזרמת cy, כשיטה מדויקת, אם כי מפרך, שיטה להערכת הפרופציט גרעינית בכבד14, בהנחה מורפולוגיה גרעינית מעגלית מערכת יחסים בין הגודל הגרעיני ותוכן ה-DNA. בפרוטוקול זה, שני הפרמטרים הגרעיניים נמדדים על ידי הערכה של מורמטריה גרעינית ו הופסט תוויות 33342. החישוב של “תוכן ה-DNA מינימלי” עבור כל מסכה גרעינית מלווה בכיול של hepatocyte הגרעין הגרעיני באמצעות NPCs, אשר יש הידוע 2 על התוכן DNA ולכן לשמש שליטה פנימית שימושי.
לעומת הזרם הקונבנציונלי cy, שיטות שירות16 הגישה המתוארת מאפשרת hepatocyte הגרעין הגרעיני כדי להיות מוערך באתרו ואינו דורש גישה לרקמה טרייה או שיטות מצבור שיכולים הטיה תוצאות ולהיות קשה לתקנן. כמו בכל הגישות המבוססות על SIA, מחלקות ההגנה הגרעינית > 2N מיוצגים באמצעות דגימת 2N בשל החשיפה של גרעין גדול מחוץ למישור המשוונית. הפרופיל ברקמות הפלואידיות מתאר גם את תוכן ה-DNA המינימלי לכל מסכות הגרעין העגולות, ואינו מפלה ישירות בין תאי הפטציטים והתאים הבינאוריים בעלי שני הגרעינים הנפרדים (“לא נוגעים”) של אותו פלויידי. עם זאת, את הפשטות של פרוטוקול זה מאפשר היקף ניכר עבור אותו להיות מותאם לחשבון עבור פרמטרים נוספים כגון מרווח בין גרעיני או ניתוח היקפי התא, זה יקל על זיהוי של תאים binuclear מתן הערכה מפורטת יותר של הסלולר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר בגישה גבוהה ובתפוקה גבוהה לניתוח שיפוץ רקמות והערכת הערכה גרעינית של הפטוציט בכבד מורטין. ברגע שהוא מכיר את הנוהל, משתמש יכול לעבד, לצלם ולנתח דגימות מרובות ב-3-5 ימים של תקופה, יצירת ערכות נתונים של ברת גדול המספקים חתימה מפורטת של בריאות הכבד. בהינתן הפשטות של שיטת ההכנה לדוגמה, יחד ע…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי הממשלה הספרדית MINECO מענקים BFU2014-58686-P (LAN) ו-2017-84708-R (DJB). LAN נתמך על ידי האגודה הלאומית מינאקו רמון את החבר RYC-2012-11700 ומתכננת פרס (Comunitat ולנסיה, CDEI-05/20-C), ו-FMN על ידי האזור ValI ו-D שמאל של ולנסיה/2016/020. RP מעוניין להכיר בפרופ ‘ Ewa ק. פלך למימון. אנו מודים לדוקטור אלישיה מרטיז-רומרו (שירות השירות הסיילאנסה) לקבלת עזרה בפלטפורמת מנתח התאים.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referências
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
