चूहों में हेपेटोसाइट न्यूक्लियर प्लॉइडी के अनुमान के लिए सीटू विधि में एक उच्च-थ्रूपुट
Summary
हम निश्चित/क्रायोपआरक्षित ऊतक नमूनों के भीतर हेपेटोसाइट संख्या और परमाणु प्लोइडी में परिवर्तन को मापने के लिए एक मजबूत, लागत प्रभावी और लचीली विधि प्रस्तुत करते हैं जिसमें प्रवाह साइटोमेट्री की आवश्यकता नहीं होती है । हमारा दृष्टिकोण जिगर की चोट और रोग की प्रगति पर नज़र रखने के लिए जिगर साइटोलॉजी आदर्श का एक शक्तिशाली नमूना-व्यापी हस्ताक्षर प्रदान करता है।
Abstract
जब जिगर घायल हो जाता है, हेपेटोसाइट संख्या कम हो जाती है, जबकि सेल आकार, परमाणु आकार और प्लॉयडी बढ़ जाती है। नॉन-पैरान्चिमल कोशिकाओं जैसे कोलैंगियोसाइट्स, मायोफिब्रोब्लास्ट, जनक और भड़काऊ कोशिकाओं का विस्तार भी क्रोनिक लिवर डैमेज, टिश्यू रीमॉडलिंग और रोग प्रगति का संकेत देता है । इस प्रोटोकॉल में, हम चोट, पुरानी बीमारी और कैंसर से जुड़े जिगर की सेलुलर संरचना में परिवर्तन की गणना के लिए एक सरल उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हम दिखाते हैं कि कैसे दो आयामी (2डी) ऊतक वर्गों से निकाली गई जानकारी का उपयोग एक नमूने के भीतर हेपेटोसाइट परमाणु प्लॉइडी को इंगित करने और जांचने के लिए किया जा सकता है और उपयोगकर्ता को सीटू में यकृत के भीतर विशिष्ट प्लाइडी सबसेट का पता लगाने में सक्षम बनाता है। हमारी विधि के लिए फिक्स्ड/फ्रोजन लिवर मटेरियल, बेसिक इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री रिएजेंट्स और किसी भी स्टैंडर्ड हाई-कंटेंट इमेजिंग प्लेटफॉर्म तक पहुंच की जरूरत होती है । यह मानक प्रवाह साइटोमेट्री तकनीकों के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में कार्य करता है, जिसके लिए ताजा एकत्र ऊतकों के व्यवधान, स्थानिक जानकारी की हानि और संभावित विशिथिलता पूर्वाग्रह की आवश्यकता होती है।
Introduction
स्तनधारी जिगर में हेपेटोसाइट्स द्विपरमाणु कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए ठप साइटोकिनेसिस से गुजर सकते हैं, और डीएनए एंडोप्रतिकृतियां 16N डीएनए सामग्री तक युक्त पॉलीप्लाइड नाभिक का उत्पादन करने के लिए। प्रसवोत्तर विकास, वृद्धावस्था और विविध सेलुलर तनाव1के जवाब में समग्र सेलुलर और परमाणु प्लॉइडी में वृद्धि । पॉलीप्लॉयडाइजेशन की प्रक्रिया गतिशील और प्रतिवर्ती2है , हालांकि इसका सटीक जैविक कार्यअस्पष्ट3 बना हुआ है . बढ़ी हुई प्लॉइडी कम होने की प्रजनन क्षमता4, आनुवंशिक विविधता2, पुरानी चोट5 और कैंसर संरक्षण6के अनुकूलन से जुड़ी हुई है । हेपेटोसाइट प्लॉइडी परिवर्तन बदल सर्कैडियन लय7औरप्रात:8 के परिणामस्वरूप होते हैं । सबसे विशेष रूप से, जिगर की प्लॉयडी प्रोफ़ाइल चोट और रोग9से बदल जाती है, और सम्मोहक साक्ष्य से पता चलता है कि विशिष्ट प्लॉयडी परिवर्तन, जैसे कि बढ़ी हुई ‘8एन नाभिक या 2एन हेपेटोसाइट्स की हानि, गैर-मादक फैटी यकृत यकृत रोग (NAFLD) प्रगति3,,10,या वायरल संक्रमण11के अंतर प्रभाव पर नज़र रखने के लिए उपयोगी हस्ताक्षर प्रदान करते हैं।
सामान्य शब्दों में, जिगर की चोट और उत्थान हेपेटोसाइट सेल आकार और परमाणु क्षेत्र12में वृद्धि के साथ जुड़े हुए हैं, साथ ही हेपेटोसाइट्स की समग्र संख्या में कमी के साथ, विशेष रूप से 2N डीएनए सामग्री10,,11के साथ उन । जिगर में पैरान्चिमल चोट भी अक्सर गैर-पैराचिमल कोशिकाओं (एनपीसी) के विस्तार के साथ होती है, जिसमें स्ट्रोमल मायोफीब्रोब्लास्ट, भड़काऊ कोशिकाएं और बाइपोटलिवर प्रोजेनिटर कोशिकाएं शामिल होती हैं। उच्च थ्रूपुट विधियां जो पैरान्चिमल सेल संख्या और परमाणु प्लॉइडी का मात्रात्मक साइटोलॉजिकल प्रोफाइल प्रदान करते हैं, जबकि एनपीसी में परिवर्तन के लिए भी लेखांकन करते हैं, इसलिए चोट और बीमारी के दौरान यकृत की प्रतिक्रिया को ट्रैक करने के लिए अनुसंधान और नैदानिक उपकरणों के रूप में काफी क्षमता होती है। हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के मानव नमूनों में प्लॉइडी स्पेक्ट्रा के सीटू विश्लेषण में हाल ही में सम्मोहक यह भी प्रदर्शित करता है कि ट्यूमर के भीतर परमाणु प्लॉयडी नाटकीय रूप से बढ़ जाती है और विशेष रूप से टीपी5313के कम भेदभाव और हानि के साथ अधिक आक्रामक ट्यूमर उपप्रकारों में परिलक्षित होती है। इसलिए, इस बात की प्रबल संभावना है कि परमाणु प्लॉइडी के मात्रात्मक मूल्यांकन में पद्धतिगत प्रगति भविष्य में यकृत कैंसर की शकुन प्रोफाइलिंग में सहायता करेगी ।
इस प्रोटोकॉल में, माउस यकृत ऊतक वर्गों के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक लचीली उच्च-थ्रूपुट पद्धति वर्णित है, जो हेपेटोसाइट संख्याओं, एनपीसी प्रतिक्रिया और परमाणु प्लॉइडी(चित्रा 1)का आकलन करने के लिए आंतरिक रूप से कैलिब्रेटेड विधि की विस्तृत साइटोमेट्रिक प्रोफाइलिंग प्रदान करती है। हेपेटोसाइट्स को परमाणु आकार और परमाणु मोर्पोमेट्री के लक्षण वर्णन से पहले हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ4α) इम्यूनोलेबलिंग द्वारा एनपीसी से प्रतिष्ठित किया जाता है। “न्यूनतम डीएनए सामग्री” का अनुमान सभी परिपत्र परमाणु मास्क के लिए मतलब Hoechst 33342 तीव्रता (डीएनए घनत्व के लिए एक प्रॉक्सी) इंटरपोलेट त्रि-आयामी (3 डी) परमाणु मात्रा के साथ एकीकृत करके किया जाता है। हेपेटोसाइट न्यूनतम डीएनए सामग्री को परमाणु प्लॉइडी प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एनपीसी का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जाता है।
छवि अधिग्रहण, परमाणु विभाजन और छवि विश्लेषण उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग करके किया जाता है, जिससे दो आयामी (2डी) यकृत वर्गों के बड़े क्षेत्रों की जांच की जा सके । सभी परिपत्र हेपेटोसाइट न्यूक्लिक के लिए नमूना-व्यापी प्लॉइडी प्रोफ़ाइल का उत्पादन करने के लिए उच्च सामग्री छवि विश्लेषण डेटा के स्वचालित पोस्ट-प्रोसेसिंग के लिए एक कस्टम-लिखित कार्यक्रम प्रदान किया जाता है। यह स्टीरियोलॉजिकल छवि विश्लेषण (एसआईए)10,11,,14,15के आधार पर परमाणु प्लाइडी की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र उपयोग करके किया जाता है। SIA पद्धति पहले एक सटीक, हालांकि श्रमसाध्य, जिगर14में हेपेटोसाइट परमाणु ploidy का आकलन करने के लिए विधि के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मान्य किया गया है, परिपत्र परमाणु आकृति विज्ञान और परमाणु आकार और डीएनए सामग्री के बीच एक मोनोटोनिक संबंध संभालने । इस प्रोटोकॉल में परमाणु मॉर्थोमेट्री और होचस्ट 33342 लेबलिंग के आकलन से दोनों परमाणु मापदंडों को मापा जाता है। प्रत्येक परमाणु मुखौटा के लिए “न्यूनतम डीएनए सामग्री” की गणना एनपीसी का उपयोग करके हेपेटोसाइट परमाणु प्लाइडी के अंशांकन के बाद की जाती है, जिसमें एक ज्ञात 2−4N डीएनए सामग्री है और इसलिए एक उपयोगी आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करती है।
पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री विधियों की तुलना में16 वर्णित दृष्टिकोण हेपेटोसाइट परमाणु प्लॉइडी को सीटू में मूल्यांकन करने में सक्षम बनाता है और ताजा ऊतक या विसग्रीकरण विधियों तक पहुंच की आवश्यकता नहीं होती है जो परिणामों को पूर्वाग्रह कर सकते हैं और मानकीकरण करना मुश्किल हो सकता है। सभी एसआईए-आधारित दृष्टिकोणों के साथ, भूमध्य रेखीय विमान के बाहर बड़े नाभिक की धारा ओं के कारण परमाणु प्लॉइडी उपवर्ग ों और gt;2N को 2डी नमूने द्वारा कम प्रतिनिधित्व दिया जाता है। ऊतक-व्यापी प्लॉइडी प्रोफ़ाइल सभी परिपत्र हेपेटोसाइट परमाणु मास्क के लिए न्यूनतम डीएनए सामग्री का वर्णन करती है, और एक ही प्लॉयडी के दो असतत (“गैर-स्पर्श”) न्यूली हैं, मोनोन्यूक्लियर हेपेटोसाइट्स और द्विपरमाणु कोशिकाओं के बीच सीधे भेदभाव नहीं करती है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की सादगी के लिए यह काफी गुंजाइश की अनुमति देता है जैसे अंतरपरमाणु रिक्ति या सेल परिधि विश्लेषण के रूप में अतिरिक्त मापदंडों के लिए खाते में अनुकूलित किया जा करने के लिए, कि सेलुलर ploidy का एक अधिक विस्तृत आकलन प्रदान द्विपरमाणु कोशिकाओं की पहचान की सुविधा होगी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मूत्र जिगर में हेपेटोसाइट न्यूक्लियर प्लॉइडी के ऊतकों के विश्लेषण और अनुमान के लिए एक उच्च सामग्री, उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण वर्णित है। प्रक्रिया से परिचित होने के बाद, एक उपयोगकर्ता 3−5 दिन की अवधि में ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्पेनिश MINECO सरकार अनुदान BFU2014-58686-P (LAN) और एसएएफ-2017-84708-R (DJB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । लैन को एक राष्ट्रीय MINECO Ramón y Cajal फैलोशिप RYC-2012-11700 और योजना GenT पुरस्कार (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), और एक क्षेत्रीय Vali + डी छात्र द्वारा वैलेंसियाई Generalitat ACIF/2016/020 द्वारा समर्थित था । आरपी फंडिंग के लिए प्रो इवा के पालुच को स्वीकार करना चाहेंगे। हम इन सेल एनालाइजर प्लेटफॉर्म के साथ मदद के लिए डॉ एलिसिया मार्टिनेज-रोमेरो (सीआईपीएफ साइटोमेट्री सेवा) का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
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