Un método in situ de alto rendimiento para la estimación de la ploideide nuclear de hepatocitos en ratones
Summary
Presentamos un método robusto, rentable y flexible para medir los cambios en el número de hepatocitos y la ploidía nuclear dentro de muestras de tejido fijo/crioconservado que no requieren citometría de flujo. Nuestro enfoque proporciona una poderosa firma de citología hepática en toda la muestra ideal para rastrear la progresión de las lesiones y enfermedades hepáticas.
Abstract
Cuando el hígado se lesiona, el número de hepatocitos disminuye, mientras que el tamaño de la célula, el tamaño nuclear y la estratada aumentan. La expansión de las células no parénquimales como los colangiocitos, los miofibroblastos, los progenitores y las células inflamatorias también indican daño hepático crónico, remodelación tisular y progresión de la enfermedad. En este protocolo, describimos un enfoque simple de alto rendimiento para calcular los cambios en la composición celular del hígado que están asociados con lesiones, enfermedades crónicas y cáncer. Mostramos cómo la información extraída de las secciones de tejido bidimensional (2D) se puede utilizar para cuantificar y calibrar la ploideide nuclear de hepatocitos dentro de una muestra y permitir al usuario localizar subconjuntos específicos de ploidicia dentro del hígado in situ. Nuestro método requiere acceso a material hepático fijo/congelado, reactivos básicos de inmunocitoquímica y cualquier plataforma de imágenes estándar de alto contenido. Sirve como una poderosa alternativa a las técnicas estándar de citometría de flujo, que requieren la interrupción del tejido recién recolectado, la pérdida de información espacial y el posible sesgo de desagregación.
Introduction
Los hepatocitos en el hígado de los mamíferos pueden someterse a citoquinesis estancada para producir células binucleares, y endoreplicación de ADN para producir núcleos de poliploide que contienen hasta 16N de contenido de ADN. Aumento general de la ploideide celular y nuclear durante el desarrollo postnatal, envejecimiento y en respuesta a diversas tensiones celulares1. El proceso de poliploidización es dinámico y reversible2,aunque su función biológica precisa sigue sin estar clara3. El aumento de la ploideidey se asocia con una capacidad proliferativa reducida4,diversidad genética2,adaptación a la lesión crónica5 y protección contra el cáncer6. Las alteraciones de la estratadia de hepatocitos se producen como resultado de la alteración del ritmo circadiano7,y el destete8. En particular, el perfil de ploide del hígado se ve alterado por la lesión y la enfermedad9, y la evidencia convincente sugiere que cambios específicos de ploidey, tales como aumento de los núcleos 8N o pérdida de hepatocitos 2N, proporcionan firmas útiles para el seguimiento de la progresión delaenfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD)3,10, o el impacto diferencial de las infecciones virales11.
En términos generales, la lesión hepática y la regeneración se asocian con el aumento del tamaño de las células de hepatocitos y el área nuclear12,junto con el número total reducido de hepatocitos, en particular aquellos con contenido de ADN 2N10,11. La lesión parenquimal en el hígado también se acompaña con frecuencia de la expansión de células no parénquimales (NNJ), incluyendo miofibroblastos estromales, células inflamatorias y células progenitoras hepáticas bipotentes. Los métodos de alto rendimiento que proporcionan un perfil citológico cuantitativo del número de células parénquimas y la ploidía nuclear, al tiempo que tienen en cuenta los cambios en los PNJ, tienen por lo tanto un potencial considerable como herramientas clínicas y de investigación para rastrear la respuesta del hígado durante la lesión y la enfermedad. El análisis in situ reciente conmovedor de espectros ploidy en muestras humanas de carcinoma hepatocelular también demuestra que la ploidicia nuclear aumenta dramáticamente dentro de los tumores y se amplifica específicamente en subtipos tumorales más agresivos con diferenciación reducida y pérdida de TP5313. Por lo tanto, existe una fuerte posibilidad de que los avances metodológicos en la evaluación cuantitativa de la ploidía nuclear ayuden en la elaboración de perfiles de pronóstico futuros del cáncer de hígado.
En este protocolo, se describe una metodología flexible de alto rendimiento para el análisis comparativo de secciones de tejido hepático de ratón, que proporciona perfiles citométricos detallados de los números de hepatocitos, la respuesta NPC y un método calibrado internamente para estimar la ploidía nuclear(Figura 1). Los hepatocitos se distinguen de los NNP por el inmunoetiquetado alfa del factor nuclear de hepatocitos 4 (HNF4), antes de la caracterización del tamaño nuclear y la morfometría nuclear. Se estima el “contenido mínimo de ADN” para todas las máscaras nucleares circulares integrando la intensidad media de Hoechst 33342 (un proxy para la densidad de ADN) con volumen nuclear tridimensional interpolado (3D). El contenido mínimo de ADN de los hepatocitos se calibra utilizando PNJ para generar un perfil de ploidy nuclear.
La adquisición de imágenes, la segmentación nuclear y el análisis de imágenes se realizan utilizando imágenes de alto contenido, lo que permite examinar grandes áreas de secciones hepáticas bidimensionales (2D) que contienen decenas de miles de células. Se proporciona un programa escrito a medida para el procesamiento posterior automatizado de datos de análisis de imágenes de alto contenido para producir un perfil de ploidy en toda la muestra para todos los núcleos de hepatocitos circulares. Esto se realiza utilizando software de descarga gratuita para calcular la ploidicia nuclear basada en el análisis de imágenes estereológicas (SIA)10,11,14,15. La metodología SIA ha sido previamente validada por la citometría de flujo como un método preciso, aunque laborioso, para estimar la ploidía nuclear de hepatocitos en el hígado14,asumiendo la morfología nuclear circular y una relación monotónica entre el tamaño nuclear y el contenido de ADN. En este protocolo, ambos parámetros nucleares se miden mediante la evaluación de la morfometría nuclear y el etiquetado Hoechst 33342. El cálculo del “contenido mínimo de ADN” para cada máscara nuclear es seguido por la calibración de la ploideide nuclear de hepatocitos utilizando PNJ, que tienen un contenido de ADN de 2 x 4N conocido y, por lo tanto, sirven como un control interno útil.
En comparación con los métodos convencionales de citometría de flujo16, el enfoque descrito permite evaluar in situ la ploidía nuclear de hepatocitos y no requiere acceso a métodos de tejido fresco o desagregación que puedan sesgar los resultados y ser difíciles de estandarizar. Al igual que con todos los enfoques basados en SIA, las subclases de ploidey nuclear >2N están subrepresentadas por el muestreo 2D debido a la sección de núcleos más grandes fuera del plano ecuatorial. El perfil de ploidy de todo el tejido también describe el contenido mínimo de ADN para todas las máscaras nucleares de hepatocitos circulares, y no discrimina directamente entre los hepatocitos mononucleares y las células binucleares que tienen dos núcleos discretos (“sin tocar”) de la misma estratapidia. Sin embargo, la simplicidad de este protocolo permite adaptar un margen considerable para que tenga en cuenta parámetros adicionales como el espaciado internuclear o el análisis perimetral celular, que facilitarían la identificación de células binucleares que proporcionen una evaluación más detallada de la ploideideidería celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un enfoque de alto contenido y alto rendimiento para el análisis de la remodelación de tejidos y la estimación de la ploideide nuclear de hepatocitos en el hígado murino. Una vez familiarizado con el procedimiento, un usuario puede procesar, crear imágenes y analizar varias muestras en un período de 3 a 5 días, generando grandes conjuntos de datos comprobables que proporcionan una firma detallada de la salud del hígado. Dada la simplicidad del método de preparación de la muestra, junto con el gran n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por las subvenciones del Gobierno español de MINECO BFU2014-58686-P (LAN) y SAF-2017-84708-R (DJB). LAN fue apoyada por una beca nacional MINECO Ramón y Cajal RYC-2012-11700 y el premio Plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), y FMN por una beca regional ValI+D de la Generalitat Valenciana ACIF/2016/020. RP desea reconocer a la Prof. Ewa K. Paluch por su financiación. Agradecemos a la Dra. Alicia Martínez-Romero (servicio de citometría CIPF) por su ayuda con la plataforma IN Cell Analyzer.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referências
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
