En hög genomströmning in Situ metod för uppskattning av Hepatocyte Nuclear Ploidy hos möss
Summary
Vi presenterar en robust, kostnadseffektiv och flexibel metod för att mäta förändringar i hepatocyte nummer och nukleära ploidy inom fasta / kryoreserverade vävnadsprover som inte kräver flöde cytometri. Vår metod ger en kraftfull provomfattande signatur av lever cytologi perfekt för att spåra utvecklingen av leverskada och sjukdom.
Abstract
När levern är skadad, hepatocyte tal minskar, medan cellstorlek, nukleärstorlek och ploidy ökar. Expansionen av icke-parenkymala celler såsom cholangiocytes, myofibroblasts, stamfader och inflammatoriska celler indikerar också kronisk leverskada, vävnad remodeling och sjukdomsprogression. I detta protokoll beskriver vi en enkel hög genomströmning metod för att beräkna förändringar i den cellulära sammansättningen av levern som är associerade med skada, kronisk sjukdom och cancer. Vi visar hur information som extraheras från tvådimensionella (2D) vävnad sektioner kan användas för att kvantifiera och kalibrera hepatocyte nukleära knep inom ett prov och göra det möjligt för användaren att lokalisera specifika ploidy delmängder inom levern på plats. Vår metod kräver tillgång till fast/fryst levermaterial, grundläggande immunocytokemireagenser och alla vanliga högkvalitativa bildplattform. Det fungerar som ett kraftfullt alternativ till standard flöde cytometri tekniker, som kräver störningar av nysamlad vävnad, förlust av rumslig information och potentiella uppdelning bias.
Introduction
Hepatocyter i däggdjurlever kan genomgå avstannad cytokinesi att producera binuclear celler, och DNA endoreplication att producera polyploida kärnor som innehåller upp till 16N DNA-innehåll. Övergripande cellulära och nukleära knep ökar under postnatal utveckling, åldrande och som svar på olika cellulära påfrestningar1. Processen för polyploidatisering är dynamisk och reversibel2, även om dess exakta biologiska funktion är fortfarandeoklart 3. Ökad knep är associerad med minskad proliferative kapacitet4, genetisk mångfald2, anpassning till kronisk skada5 och cancer skydd6. Hepatocyte ploidy förändringar sker som ett resultat av förändrad dygnsrytm7, och avvänjning8. Framför allt, ploidy profilen av levern ändras av skada och sjukdom9, och övertygande bevis tyder på att specifika knep förändringar, såsom ökad ≥8N atomkärnor eller förlust av 2N hepatocyter, ger användbara signaturer för att spåra alkoholfria fettlever (NAFLD) progression3,,10, eller den differentiella effekten av virusinfektioner11.
Generellt sett är leverskada och regenerering förknippade med ökad hepatocyte cellstorlek och kärnområde12, tillsammans med minskat totalt antal hepatocyter, särskilt de med 2N DNA-halt10,11. Parenchymal skada i levern är också ofta åtföljs av expansion av icke-parenkymala celler (NPC), inklusive stromal myofibroblasts, inflammatoriska celler och bipotenta lever stamgenitor celler. Metoder med hög genomströmning som ger en kvantitativ cytologisk profil av parenkymalt cellnummer och kärnsken, samtidigt som de också står för förändringar i NPC,har därför stor potential som forskning och kliniska verktyg för att spåra leverns svar under skada och sjukdom. Övertygande senaste in situ analys av ploidy spektra i mänskliga prover av hanpatocellular carcinom visar också att nukleära knep är dramatiskt ökat inom tumörer och förstärks specifikt i mer aggressiva tumör subtyper med minskad differentiering och förlust av TP5313. Därför finns det en stor möjlighet att metodologiska framsteg i kvantitativ bedömning av nukleära knep kommer att bidra till framtida prognostisk profilering av levercancer.
I detta protokoll beskrivs en flexibel hög genomströmningsmetodik för jämförande analys av muslevvävnadssektioner, som ger detaljerad cytometrisk profilering av hepatocytenummer, NPC-svaret och en internt kalibrerad metod för att uppskatta kärntrick (figur 1). Hepatocyter skiljer sig från NPC genom hepatocyte nukleära faktor 4 alfa (HNF4α) immunmärkning, före karakterisering av nukleärstorlek och nukleära morfomi. “Minimal DNA-innehåll” uppskattas för alla cirkulära kärnmasker genom att integrera medelvärdet Hoechst 33342 intensitet (en proxy för DNA-densitet) med interpolerad tredimensionell (3D) kärnvolym. Hepatocyte minimal DNA-innehåll kalibreras sedan med hjälp av NPC för att generera en nukleär ploidy profil.
Bildinsamling, kärnsegmentering och bildanalys utförs med höginnehållsavbildning, vilket gör att stora områden med tvådimensionella (2D) leversektioner som innehåller tiotusentals celler kan kontrolleras. Ett specialskrivet program tillhandahålls för automatiserad efterbehandling av höginnehållsbildanalysdata för att producera en provomfattande ploidyprofil för alla cirkulära hepatocytekärnor. Detta utförs med hjälp av gratis för att ladda ner programvara för att beräkna nukleära knep baserat på stereological bildanalys (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden har tidigare validerats av flödescytometri som en korrekt, om än mödosam, metod för att uppskatta hepatocyte nukleära knep i levern14, förutsatt cirkulär nukleär morfologi och ett monotont förhållande mellan nukleär storlek och DNA-innehåll. I detta protokoll mäts båda nukleära parametrar genom bedömning av kärnmorometri och Hoechst 33342-märkning. Beräkning av “minimal DNA-innehåll” för varje kärnmask följs av kalibrering av hepatocytkärnacom med hjälp av NPC, som har en känd 2−4N DNA-innehåll och därför fungerar som en användbar intern kontroll.
Jämfört med konventionella flöde cytometri metoder16 den metod som beskrivs gör hepatocyte nukleära knep som skall bedömas på plats och kräver inte tillgång till färsk vävnad eller disaggregering metoder som kan bias resultat och vara svårt att standardisera. Som med alla SIA-baserade metoder är underklasser av kärnlexi >2N underrepresenterade genom 2D-provtagning på grund av snittning av större kärnor utanför ekvatorialplanet. Den vävnadsomfattande ploidyprofilen beskriver också det lägsta DNA-innehållet för alla cirkulära hepatocytekärnmasker och diskriminerar inte direkt mellan mononukleära hepatocyter och binukleära celler som har två diskreta (icke-rörande) kärnor av samma knep. Enkelheten i detta protokoll ger dock stort utrymme för att anpassas för att ta hänsyn till ytterligare parametrar såsom internukleära avstånd eller cell perimeteranalys, som skulle underlätta identifiering av binukleära celler som ger en mer detaljerad bedömning av cellulära knep.
Protocol
Representative Results
Discussion
En hög-innehåll, hög genomströmning strategi för analys av vävnad ombyggnad och uppskattning av hepatocyte nukleära ploidy i murine levern beskrivs. När en användare är bekant med proceduren kan han eller hon bearbeta, avbilda och analysera flera exempel under en 3–5-dagarsperiod, vilket genererar stora testbara datauppsättningar som ger en detaljerad signatur av leverhälsa. Med tanke på att provberedningsmetoden är enkel, tillsammans med det stora antalet analyserade celler och vävnadsyta (i genomsnitt …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av den spanska MINECO regeringens bidrag BFU2014-58686-P (LAN) och SAF-2017-84708-R (DJB). LAN stöddes av en nationell MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 och Plan GenT award (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) och FMN av ett regionalt ValI+D studentskap i Valencias Generalitat ACIF/2016/020. RP vill tacka professor Ewa K. Paluch för finansiering. Vi tackar Dr Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometri tjänst) för hjälp med IN Cell Analyzer plattform.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referências
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
