Farelerde Hepatosit Nükleer Ploidi Tahmini için Yerinde Yüksek Throughput Yöntemi
Summary
Akış sitometrisi gerektirmeyen sabit/kriyokorunmuş doku örneklerinde hepatosit numarası ve nükleer ploidideki değişiklikleri ölçmek için sağlam, uygun maliyetli ve esnek bir yöntem saseril. Yaklaşımımız karaciğer hasarı ve hastalığın ilerlemesini izlemek için ideal karaciğer sitolojisi güçlü bir örnek çapında imza sağlar.
Abstract
Karaciğer yaralandığında hepatosit sayıları azalır, hücre büyüklüğü ise, nükleer boyutu ve ploidi artar. Kolanjiyositler, miyofibroblastlar, atalar ve inflamatuar hücreler gibi parenkimal olmayan hücrelerin genişlemesi de kronik karaciğer hasarı, doku remodeling ve hastalığın ilerlemesini gösterir. Bu protokolde, karaciğerin hücresel bileşiminde yaralanma, kronik hastalık ve kanserle ilişkili değişiklikleri hesaplamak için basit bir yüksek iş ilişkisi yaklaşımını tanımlıyoruz. İki boyutlu (2D) doku bölümlerinden elde edilen bilgilerin, bir numune içinde hepatosit nükleer ploidiyi ölçmek ve kalibre etmek ve kullanıcının karaciğer içinde belirli ploidi alt kümeleri yerinde bulmasını sağlamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Yöntemimiz sabit/dondurulmuş karaciğer materyaline, temel immünositokimya reaktiflerine ve herhangi bir standart yüksek içerikli görüntüleme platformuna erişim gerektirir. Bu taze toplanan doku bozulması, mekansal bilgi kaybı ve potansiyel disaggregasyon önyargı gerektiren standart akış sitometri teknikleri, güçlü bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Introduction
Memeli karaciğerindeki hepatositler, binükleer hücreler üretmek için durmuş sitokineze ve 16N DNA içeriği içeren poliploid çekirdekleri üretmek için DNA endorepasyonuna uğrayabilirler. Doğum sonrası gelişim sırasında genel hücresel ve nükleer ploidi artışı, yaşlanma ve çeşitli hücresel streslere yanıtolarak 1. Poliploidizasyon süreci dinamik ve geri dönüşümlü2, kesin biyolojik işlevi belirsiz kalırken3. Artmış ploidi azaltılmış proliferatif kapasite ile ilişkilidir4, genetik çeşitlilik2, kronik yaralanma adaptasyon5 ve kanserden korunma6. Hepatosit ploidi değişiklikler değişmiş sirkadiyenritimsonucu ortaya 7 , ve keserek8. En önemlisi, karaciğer ploidi profili yaralanma ve hastalıktarafındandeğiştirilir 9 , ve zorlayıcı kanıtlar belirli ploidi değişiklikler, artmış ≥8N çekirdekleri veya 2N hepatosit kaybı gibi, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı izlemek için yararlı imzalar sağlamak düşündürmektedir (NAFLD)3,10, veya viral enfeksiyonların diferansiyel etkisi11.
Genel anlamda, karaciğer hasarı ve rejenerasyon artmış hepatosit hücre büyüklüğü ve nükleer alan ile ilişkilidir12, hepatosit azaltılmış genel sayılar ile birlikte, özellikle 2N DNA içeriği10olanlar10 ,11. Karaciğerde parenkimal yaralanma da sıklıkla non-parenkimal hücrelerin genişlemesi eşlik (NPCs), stromal miyofibroblastlar da dahil olmak üzere, inflamatuar hücreler ve bipotent karaciğer ata hücreleri. Parenkimal hücre numarası ve nükleer ploidin nicel sitolojik profilini sağlayan yüksek iş parçacığı yöntemleri, nfc’lerde ki değişiklikleri de hesaba katarken, bu nedenle yaralanma ve hastalık sırasında karaciğerin yanıtını takip etmek için araştırma ve klinik araçlar olarak önemli bir potansiyele sahiptir. Hepatosellüler karsinom insan örneklerinde ploidy spektrumların yerinde analizi zorlayıcı son da nükleer ploidi önemli ölçüde tümörler içinde artar ve özellikle azaltılmış farklılaşma ve TP53 kaybı ile daha agresif tümör alt tipleri amplifiye olduğunu göstermektedir13. Bu nedenle, nükleer ploidi kantitatif değerlendirmede metodolojik gelişmeler karaciğer kanserinin gelecekteki prognostik profilleme yardımcı olacağını güçlü bir olasılık vardır.
Bu protokolde, fare karaciğer doku kesitlerinin karşılaştırmalı analizi için esnek bir yüksek iş lenme metodolojisi tanımlanmış olup, hepatosit sayılarının ayrıntılı sitometrik profillemesi, NPC yanıtı ve nükleer ploidiyi tahmin etmek için dahili olarak kalibre edilmiş bir yöntem(Şekil 1). Hepatositler ncd’lerden hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) immünetiketleme ile nükleer boyut ve nükleer morfometri karakterizasyonundan önce ayrılırlar. “Minimal DNA içeriği” ortalama Hoechst 33342 yoğunluğu (DNA yoğunluğu için bir proxy) interpole üç boyutlu (3D) nükleer hacim ile entegre ederek tüm dairesel nükleer maskeler için tahmin edilmektedir. Hepatosit minimal DNA içeriği daha sonra nükleer ploidi profili oluşturmak için NFC’ler kullanılarak kalibre edilir.
Görüntü edinimi, nükleer segmentasyon ve görüntü analizi yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir ve on binlerce hücreiçeren iki boyutlu (2D) karaciğer bölümlerinin geniş alanlarının taranmasını sağlar. Tüm dairesel hepatosit çekirdekleri için örnek geniş ploidi profili oluşturmak için yüksek içerikli görüntü analizi verilerinin otomatik olarak işlenmesi için özel olarak yazılmış bir program sağlanmaktadır. Bu stereoolojik görüntü analizi (SIA)10,11,,14,15dayalı nükleer ploidy hesaplamak için yazılım indirmek için ücretsiz kullanılarak gerçekleştirilir. SIA metodolojisi daha önce dairesel nükleer morfolojisi ve nükleer boyut ve DNA içeriği arasında monoton bir ilişki varsayarak, karaciğer14hepatosit nükleer ploidi tahmin etmek için doğru, zahmetli de olsa, doğru bir yöntem olarak akış sitometri tarafından doğrulanmıştır. Bu protokolde, her iki nükleer parametre de nükleer morfometri ve Hoechst 33342 etiketleme nin değerlendirilmesi ile ölçüldü. Her nükleer maske için “minimal DNA içeriğinin” hesaplanması, bilinen 2−4N DNA içeriğine sahip olan ve bu nedenle yararlı bir iç kontrol görevi gören NPT’ler kullanılarak hepatosit nükleer ploidin kalibrasyonu ile takip edilir.
Konvansiyonel akış sitometri yöntemleri ile karşılaştırıldığında16 açıklanan yaklaşım hepatosit nükleer ploidi yerinde değerlendirilmesini sağlar ve sonuçları önyargı ve standartlaştırmak zor taze doku veya disaggregasyon yöntemlerine erişim gerektirmez. Tüm SIA tabanlı yaklaşımlarda olduğu gibi, nükleer ploidi alt sınıfları >2N ekvator düzlemi dışında büyük çekirdeklerin kesiti nedeniyle 2B örnekleme ile yeterince temsil edilmiştir. Doku çapında ploidi profili de tüm dairesel hepatosit nükleer maskeler için minimum DNA içeriğini açıklar ve doğrudan mononükleer hepatositler ve aynı ploidi iki ayrık (“dokunmaz”) çekirdekleri var binükleer hücreler arasında ayrım yapmaz. Ancak, bu protokolün basitliği, hücre içi ploidin daha ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlayan iki nükleer hücrelerin belirlenmesini kolaylaştıracak, nükleer aralık lar veya hücre çevre analizi gibi ek parametrelere göre uyarlanması için önemli bir kapsam sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minür karaciğerde doku remodeling ve hepatosit nükleer ploidi tahmini analizi için yüksek içerikli, yüksek iş çıkışlı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bir kez prosedür aşina, bir kullanıcı işleyebilir, görüntü ve 3−5 günlük bir süre içinde birden fazla örnek analiz, karaciğer sağlığı ayrıntılı bir imza sağlayan büyük test edilebilir veri kümeleri üreten. Örnek hazırlama yönteminin basitliği göz önüne alındığında, analiz edilen çok sayıda hücre ve doku alanı (ortal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İspanyol MINECO Hükümeti tarafından finanse edilmiştir BFU2014-58686-P (LAN) ve SAF-2017-84708-R (DJB). LAN ulusal MINECO Ramón y Cajal Bursu RYC-2012-11700 ve Plan GenT ödülü (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) ve FMN tarafından Valencian Generalitat ACIF/2016/020 bölgesel ValI +D öğrenciliği tarafından desteklendi. RP, Prof. Ewa K. Paluch’a fon için teşekkür etmek istiyorum. Biz IN Hücre Analizörü platformu ile yardım için Dr Alicia Martínez-Romero (CIPF Sitometri hizmeti) teşekkür ederiz.
Materials
| 3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
| IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
| Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
| Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
| Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
| Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |
Referências
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?. Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
- Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
- Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
- Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
- Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
- Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
- Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
- Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
- Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
- Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
- Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
- Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
- Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy – I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
- Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
- Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
- Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
- Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
- Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
- Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
- Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
- Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
- Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).
