Ion Mobility-massaspectrometrie en moleculaire modelleringstechnieken kunnen de selectieve metaal chelerende werking van ontworpen metaal bindende peptiden en de koper bindende peptide methanobactin karakteriseren. Ontwikkeling van nieuwe klassen van metaal chelerende peptiden zal helpen leiden tot therapieën voor ziekten in verband met metaalionen misbalans.
Elektro spray ionisatie (ESI) kan een waterige-fase peptide of peptide complex overdragen naar de gasfase terwijl het de massa, totale lading, metaal bindende interacties en conformationele vorm behouden. Koppeling ESI met Ion Mobility-massaspectrometrie (IM-MS) biedt een instrumentale techniek die gelijktijdige meting van de massa-to-charge (m/z) en Collision cross sectie (CCS) van een peptide die betrekking hebben op zijn stoichiometry, protonatie toestand, en conformationele vorm. De totale lading van een peptide complex wordt gecontroleerd door de protonatie van 1) de peptide zure en fundamentele sites en 2) de oxidatietoestand van de metalen Ion (s). Daarom is de totale charge toestand van een complex een functie van de pH van de oplossing die de peptiden metaal ion binding affiniteit beïnvloedt. Voor ESI-IM-MS-analyses worden peptide-en metaalionen oplossingen bereid uit waterige oplossingen, waarbij de pH wordt aangepast met verdund waterig azijnzuur of ammoniumhydroxide. Dit maakt het mogelijk om pH-afhankelijkheid en metaalionen selectiviteit te bepalen voor een specifiek peptide. Verder kan de m/z en CCS van een peptide complex worden gebruikt met B3LYP/LanL2DZ moleculaire modellering om bindende locaties van de metaalionen coördinatie en tertiaire structuur van het complex te onderscheiden. De resultaten laten zien hoe ESI-IM-MS de selectieve chelerende werking van een set alternatieve methanobactin peptiden kan karakteriseren en vergelijken met de koper bindende peptide methanobactin.
Koper en zink ionen zijn essentieel voor levende organismen en cruciaal voor processen met inbegrip van oxidatieve bescherming, weefsel groei, ademhaling, cholesterol, glucose metabolisme, en genoom lezing1. Om deze functies mogelijk te maken, nemen groepen zoals het thiolaat van CYS, imidazol van zijn2,3, (meer zelden) verschillende van methionine en carboxylaat van Glu en ASP selectief metalen op als cofactoren in de actieve gebieden van metalloenzymen. De gelijkenis van deze coördinatiegroepen werpt een intrigerende vraag op over hoe de liganden van zijn en CYS selectief cu (I/II) of Zn (II) opnemen om een correcte werking te garanderen.
Selectieve binding wordt vaak bewerkstelligd door peptiden voor acquisitie en handel, die Zn (II) of cu (I/II) ionen concentraties controleren4. Cu (I/II) is zeer reactief en veroorzaakt oxidatieve schade of onvoorziene binding aan enzymen, dus de vrije concentratie is strak gereguleerd door koperen chaperonnes en koper-regulerende eiwitten die het veilig vervoeren naar verschillende locaties in de cel en strak controle van de homeostase5,6. Verstoring van het koper metabolisme of homeostase is direct betrokken bij Menkes en de ziekte van Wilson7 evenals kanker7 en neurale aandoeningen, zoals prion8 en de ziekte van Alzheimer9.
De ziekte van Wilson wordt geassocieerd met verhoogde koper niveaus in de ogen, de lever en de delen van de hersenen, waar de redoxreacties van Cu (I/II) reactieve zuurstof soorten produceren, waardoor hepatolenticulaire en neurologische degeneratie. Bestaande chelatie therapieën zijn het kleine thiolaminozuur Penicillamine en Triethyleentetramine. Als alternatief, de methanotrofische koper-acquisitie peptiden methanobactin (MB)10,het therapeutischepotentieel vertonen door hun hoge binding affiniteit voor cu (I)12. Toen de methanobactin (MB-OB3b) uit Methylosinus trichosporium OB3b werd bestudeerd in een diermodel van de ziekte van Wilson, werd koper efficiënt uit de lever gehaald en uitgescheiden via de gal13. In vitro experimenten bevestigd dat MB-OB3b het koper kan cheleren uit de koper metallothioneïneproductie opgenomen in de lever cytosol13. Laser ablatie inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie beeldvormende technieken hebben de ruimtelijke verdeling van koper in de ziekte van Wilson lever monsters14,15,16 onderzocht en aangetoond dat MB-OB3b verwijdert het koper met korte behandelingsperioden van slechts 8 dagen17.
De MB-OB3b zal ook binden aan andere metaalionen, waaronder AG (I), au (III), PB (II), MN (II), Co (II), Fe (II), ni (II) en Zn (II)18,19. Competitie voor de fysiologische cu (I) binding site wordt tentoongesteld door AG (I) omdat het cu (I) kan verdringen van het MB-OB3b complex, met zowel AG (I) en ni (II) ook tonen onomkeerbare binding aan MB die niet kan worden verplaatst door cu (I)19. Onlangs is een reeks alternatieve methanobactin (amb) oligopeptides met het 2his-2cys binding motief onderzocht20,21, en hun Zn (II) en cu (I/II) binding eigenschappen gekarakteriseerd. Hun primaire aminozuur sequenties zijn vergelijkbaar, en ze bevatten allemaal de 2His-2Cys motief, Pro en een geacetseerd N-Terminus. Ze verschillen voornamelijk van MB-OB3b omdat het 2His-2Cys motief de twee enethiol oxazolone binding sites van MB-OB3b vervangt.
Elektro spray-ionisatie in combinatie met ionen mobiliteit-massaspectrometrie (ESI-IM-MS) voorziet in een krachtige instrumentale techniek voor het bepalen van de metaal bindende eigenschappen van peptiden omdat het hun massa-tot-lading (m/z) en botsing doorsnede (CCS) terwijl de massa, lading en conformatie vorm van de oplossingsfase behouden blijven. De m/z en CCS hebben betrekking op de peptiden stoichiometrie, protonatie toestand en conformationale vorm. Stoichiometrie wordt bepaald omdat de identiteit en het nummer van elk element dat aanwezig is in de soort expliciet worden geïdentificeerd. De totale lading van het peptide complex heeft betrekking op de protonatie toestand van de zure en fundamentele plaatsen en de oxidatietoestand van het metaal ion (s). De CCS geeft informatie over de conformationele vorm van het peptide complex, omdat het de rotatie gemiddelde grootte meet die betrekking heeft op de tertiaire structuur van het complex. De totale laadtoestand van het complex is ook een functie van pH en beïnvloedt de metaalionen binding van de peptide, omdat de gedeprotoneerde basis-of zure plaatsen zoals de carboxyl, his, CYS en Tyr ook de potentiële bindingsplaatsen voor het metaal-ion zijn. Voor de analyses worden de peptide en het metaal ion bereid in waterige oplossingen met de pH aangepast door verdund waterig azijnzuur of ammoniumhydroxide. Hierdoor kan de pH-afhankelijkheid en de selectiviteit van de metaalionen worden bepaald voor de peptide. Bovendien kunnen de m/z en CCS bepaald door ESI-im-MS worden gebruikt met B3LYP/LanL2DZ moleculaire modellering om het type van de metaalionen coördinatie en tertiaire structuur van het complex te ontdekken. De resultaten in dit artikel laten zien hoe ESI-IM-MS de selectieve chelerende werking van een set amb peptiden kan karakteriseren en vergelijken met de koper bindende peptide MB-OB3b.
Kritieke stappen: behouden oplossingsfase gedrag voor onderzoek via ESI-im-MS
Native ESI instrumentale instellingen moeten worden gebruikt die behoud van de peptiden stoichiometrie, Charge State, en conformationele structuur. Voor inheemse omstandigheden moeten de omstandigheden in de ESI-bron, zoals de kegel spanningen, temperaturen en gasstromen, worden geoptimaliseerd. Ook moeten de druk en spanningen in de bron, val, Ion mobiliteit en overdracht reizen golven (vooral de DC-trap bias die de injecti…
The authors have nothing to disclose.
Dit materiaal is gebaseerd op het werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder 1764436, NSF-instrument ondersteuning (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014) en computerbronnen van het ministerie van energie (TX-W-20090427-0004-50) en L3 Communications . We danken de Bowers groep van de Universiteit van Californië-Santa Barbara voor het delen van het Sigma-programma en Ayobami Ilesanmi voor het demonstreren van de techniek in de video.
acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 255599-5G | |
copper(II) chloride 99.999% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203149-10G | |
copper(II) nitrate hydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 229636-5G | |
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides | Neo BioLab (neobiolab.com) | designed peptides were synthized by order | |
designed amb5B,C,D,E,F peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b | cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce) | ||
glacial acetic acid (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12357-09 | |
lead(II) nitrate ACS grade | Avantor (www.avantormaterials.com) | 128545-50G | |
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203734-5G | |
MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
nickel chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203866-5G | |
poly-DL-alanine | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
silver nitrate 99.9%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 11414-06 | |
Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
zinc chloride anhydrous | Alfa Aesar (www.alfa.com) | A16281 |