A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.
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Artigo de método
Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Glycomics é uma nova subespecialidade em pesquisa do sistema de omics que oferece um potencial significativo na descoberta de biomarcadores de última geração para a suscetibilidade à doença, descoberta de alvos de medicamentos e medicina de precisão. Os glicanos alternativos de IgG Nforam relatados em diversas doenças crônicas comuns e sugeridos ter o grande potencial em aplicações clínicas (isto é, biomarcadores para o diagnóstico e a predição das doenças). Os igg n-glicanos são amplamente caracterizados usando o método de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho (UPLC). A UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e alta precisão quantitativa relativa. Além disso, a estrutura do IgG N-glicano é claramente separada, e a composição glicana e a abundância relativa no plasma são caracterizadas.
Introdução
N-glicosilação de proteínas humanas é uma modificação pós-translacional comum e essencial1 e pode ajudar a prever a ocorrência e o desenvolvimento de doenças com relativa precisão. Devido à complexidade de sua estrutura, espera-se que existam mais de 5.000 estruturas glicanas, proporcionando grande potencial como biomarcadores diagnósticos e preditivos para doenças2. N-glicanos ligados à imunoglobulina G (IgG) têm se mostrado essenciais para a função da IgG, e a IgG N-glicosilação participa do equilíbrio entre os sistemas pró e antiinflamatórios3. A glicosilação diferenc....
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Protocolo
Todos os assuntos incluídos no protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica capital, Pequim, China12. O consentimento informado escrito foi obtido de cada sujeito no início do estudo.
1. Isolamento igg
- Prepare os produtos químicos, incluindo tampão de ligação (soisma tampão de fosfato, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutralizando buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), eluente: 0,1 M ácido fórmico (pH = 2,5), neutralizando a solução para eluente: 1 M amônio bicarbonato, tampão armazenado: 20% etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), solução de limpeza para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-....
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Resultados
Como mostrado na Figura 1,IgG N-glicanos foram analisados em 24 picos iniciais de glicoglicemia IgG (GPs) com base no pico de posição e tempo de retenção. As estruturas N-glicanestão disponíveis através da detecção de espectrometria de massa de acordo com um estudo anterior ( Tabela1)15. Para garantir que os resultados fossem comparáveis, foi aplicada normalização total da área, na qual a quantidade d.......
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Discussão
UPLC serve como um método de análise quantitativa relativa5,15. Os resultados indicam que o UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e precisão quantitativa relativa. A quantidade de glicanos em cada pico é expressa como uma porcentagem da área integrada total usando UPLC, que é o valor relativo. A quantificação relativa melhora a comparabilidade das amostras de teste. Além disso, 96 placas G de proteína bem são usadas para purificar o.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e da Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-aminobenzamida, 2-AB | Sigma, China | ||
| Placa de coleta de 96 poços | AXYGEN | ||
| Placa filtrante de 96 poços | Pol | 0,45 um GHP | |
| Placa monolítica de 96 poços | BIA Separações | ||
| Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | T_1087461900 | ||
| Ácido acético | Sigma, China | ||
| Acetonitrila | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Bicarbonato de amônio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Formato de amônio | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Incubadora de agitação constante / balancim | Zhicheng instrumento analítico manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Escada de calibração de dextrano / coluna de glicopeptídeo | Watts technology Co., Ltd, China | Coluna | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma, China | ||
| Fosfato dissódico | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Fornos elétricos | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ácido fórmico | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Kit de rotulagem | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| Centrífuga de alta velocidade | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Centrífuga de baixa temperatura | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | ||
| Refrigerador de baixa temperatura | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96 poços | placa Watts tecnologia Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Metanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Medidor de água pura | Millipore Co., Ltd, América | Vantagem A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Testador de PH | Sartorius Co., Ltd, Alemanha | PB-10 | |
| Solução salina tamponada com fosfato, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipeta | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | 4672100, 0.5-10μ l & 10-100μ l & 20-200μ l & 1000μ l | |
| PNGase F enzima | Sigma, China | ||
| Di-hidrogenofosfato de potássio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Cloreto de sódio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Espectrofotômetro | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Pistola de transferência de líquido | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, América | ||
| Refrigerador de temperatura ultrabaixa | Thermo Co., Ltd, América | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Cromatografia líquida de ultra-desempenho | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Bomba de | vácuo Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Máquina de volatilização / secador | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Instrumentos Co. do verificador | do banho-maria | DK-98-IIA | |
| Balança de pesagem | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
Referências
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T.....
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