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Bioquímica

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

Published: September 12, 2019
doi:
10.3791/60108
, , , ,
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry,University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center,Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics,University of Cambridge

Summary

Nós descrevemos a aplicação da nanoespectroscopia infravermelha e da microscopia de alta resolução da força atômica para visualizar o processo do self-assembly da proteína em agregados oligoméricas e em fibrilas do amilóide, que é associada pròxima com o início e o desenvolvimento de uma ampla gama de distúrbios neurodegenerativos humanos.

Abstract

O fenômeno de desdobramento de proteínas e agregação resulta na formação de agregados proteicos altamente heterogêneos, que estão associados a condições neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer e Parkinson. Em particular os agregados de baixo peso molecular, oligomers do amilóide, foram mostrados para possuir Propriedades citotóxica genéricas e são implicados como neurotoxinas em muitas formas de demência. Nós ilustramos o uso de métodos baseados na microscopia de força atômica (AFM) para abordar a tarefa desafiadora de caracterizar as propriedades morfológicas, estruturais e químicas desses agregados, que são difíceis de estudar usando estruturas estruturais convencionais métodos ou métodos biofísicos em massa devido à sua heterogeneidade e natureza transitória. Abordagens de microscopia de sonda de varredura agora são capazes de investigar a morfologia de agregados amilóides com resolução de subnanômetro. Mostramos aqui que a nanoespectroscopia de infravermelho (IR) (AFM-IR), que explora simultaneamente a alta resolução do AFM e o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, pode ir mais longe e possibilitar a caracterização das propriedades estruturais de indivíduos agregados proteicos e, assim, oferecem insights sobre os mecanismos de agregação. Desde que a aproximação que nós descrevemos pode ser aplicada também às investigações das interações de conjuntos da proteína com moléculas e anticorpos pequenos, pode entregar a informação fundamental para desenvolver compostos terapêuticos novos para diagnosticar ou tratar distúrbios neurodegenerativos.

Introduction

Mais de 40 milhões pessoas em todo o mundo são atualmente afetadas por distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (AD)1 e Parkinson (PD)2 doenças. Mais geralmente, mais de 50 patologias estão associadas a nível molecular com desdobramento de proteínas e agregação, um processo que leva à proliferação de agregados protéicos insolúveis fibrilantes, conhecidos como depósitos amilóides3, 4. as origens moleculares da neurodegeneração e suas ligações com as mudanças conformacional da proteína das proteínas que conduzem à formação do amilóide, entretanto, permanecem obscuras, na grande parte por causa do nível elevado de heterogeneidade, de natureza transiente e de nanoescala dimensões dos agregados patológicos4,5.

Investigações altamente bem-sucedidas de estruturas proteicas nas últimas décadas têm sido amplamente baseadas no uso de métodos a granel, incluindo cristalografia de raios-X, microscopia crioeletrônica e espectroscopia de ressonância magnética nuclear5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9. dentro desta classe de técnicas, a espectroscopia infravermelha (ir) surgiu como uma ferramenta analítica sensível para desvendar as propriedades químicas dos sistemas biológicos, como as proteínas8. Os métodos do ir permitem a quantificação de mudanças estruturais secundárias e Quaternário da proteína durante seu proteínas e agregação. Além disso, a fim de decifrar mais a nível microscópico os detalhes mecanísticos envolvidos nas complexas paisagens energéticas livres de proteínas durante a sua agregação, um avanço importante tem sido o desenvolvimento de ferramentas de cinética química para estender a complexa caminhos de automontagem, incluindo formação de fibrilas amilóides5,6,7,10,11,12. No entanto, os métodos espectroscópicos em massa fornecem apenas informações médias sobre o conjunto heterogêneo de espécies presentes em solução ou envolvidas em etapas microscópicas específicas, tornando assim a investigação das propriedades biofísicas de indivíduos espécies agregadas desafiadoras no nível de nanoescala13,14.

Várias técnicas de microscopia com a capacidade de operar em escalas menores do que o limite de difração de luz emergiram nas últimas décadas. Esta classe de métodos inclui microscopia eletrônica (EM) e microscopia de força atômica (AFM). Enquanto a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornecem imagens bidimensionais (2D) de um espécime, AFM emergiu nas últimas décadas como uma técnica poderosa e versátil para estudar morfologias tridimensionais (3D), como bem como as propriedades Nanomecânica de uma amostra com resolução sub-nanômetro13,14,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23 anos de , 24 de cada , 25 anos de , 26 anos de , 27. a fundamentação subjacente ao estudo da agregação proteica via AFM é que essa abordagem possibilita a investigação da morfologia de espécies individuais presentes na solução13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Em particular, ao monitorar a amostra em função do tempo, o AFM possibilita a investigação da evolução da morfologia das espécies dentro da amostra, o que possibilita acompanhar e visualizar as vias de formação de amiloides23, 25,38,39,40,41,42. Além disso, a AFM possibilita a quantificação de parâmetros estruturais como alturas transversais e comprimentos das espécies individuais presentes na solução13,19,30,31 ,32,33,34,35,36, 37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. no entanto, o estudo de uma única propriedade biofísica, como a morfologia, muitas vezes não é suficiente quando se estuda sistemas biológicos heterogêneos e complexos. Os métodos de imagem AFM, SEM ou TEM sozinhos não revelam prontamente as propriedades químicas de espécies heterogêneas de agregados amilóides na nanoescala.

Um avanço importante para a análise de amostras biológicas heterogêneas nesta escala foi feito recentemente com o desenvolvimento e a aplicação ao campo da agregação da proteína da nanoespectroscopia infravermelha (AFM-ir)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este método inovativo explora a combinação da definição espacial de AFM (~ 1 − 10 nanômetro) com o poder da análise química do IR. A técnica AFM-IR é baseada na mensuração do efeito de ressonância induzida fototermal conduzido por um laser de infravermelho, e na mensuração da expansão térmica da amostra investigação pela ponta AFM. A amostra pode ser iluminada pelo laser do ir diretamente da parte superior ou da parte inferior na reflexão interna total, similarmente como na espectroscopia infravermelha convencional24,42,52,53 . O laser do IR pode ser pulsado com freqüências típicas na ordem de centenas de kilohertz (1 − 1000 quilohertz) e ajustado sobre uma escala espectral larga, tipicamente entre 1000 − 3300 cm-1. Embora a fonte de laser cubra uma área de ~ 30 μm de diâmetro, a resolução espacial da técnica AFM-IR é determinada nominalmente pelo diâmetro da ponta AFM, que detecta a expansão térmica local do sistema. AFM-ir é poço-serido para estudar amostras biológicas porque o sinal do ir é proporcional a sua espessura até 1 − 1.5 μm, e os espectros resultantes do ir são geralmente de acordo com os espectros correspondentes da transmissão de FTIR13,54 ,55. Por esta razão, métodos de análise estabelecidos na espectroscopia podem ser prontamente aplicados, como o estudo de turnos químicos, mudança de forma de banda e de-convolução pela segunda análise de derivativos52. Globalmente, combinando a resolução espacial do AFM com o poder de reconhecimento químico da espectroscopia IR, AFM-IR permite a aquisição simultânea de uma ampla gama de propriedades morfológicas, mecânicas e químicas de uma amostra na nanoescala.

Aqui, ilustramos um protocolo para a caracterização do processo de agregação proteica que explora a combinação de ensaios de fluorescência in vitro, imagem AFM de alta resolução e AFM-IR de nanoescala. Esta abordagem combinada já se destacou no fornecimento de resultados detalhados no estudo das propriedades químicas e estruturais de microgotas individuais formadas por agregados proteicos, em estudos de separação de fase proteica líquido-líquido, e em investigando a heterogeneidade e as propriedades biofísicas de espécies agregadas individuais na nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

Protocol

1. ensaios de agregação em leitores de placas de fluorescência Nota: o protocolo aqui descrito é um exemplo de como estudar a agregação de qualquer proteína ou peptídeo por cinética química. Em particular, descreve um protocolo otimizado para estudar a agregação do peptídeo aβ 42, que está envolvido no início e progressão da doença de Alzheimer58,59. Um protocolo semelhante pode ser ajustado e adotado para estudar a agr…

Representative Results

Um curso de tempo representativo da agregação aβ 42, medido pelo ensaio de fluorescência ThT, é mostrado na Figura 1. O processo de agregação é comumente caracterizado por uma curva sigmoidal, onde uma fase de retardo é inicialmente observada, e é seguida por uma fase de crescimento íngreme, antes que a curva atinja um planalto quando um estado estacionário de equilíbrio é atingido6,7 , 58</…

Discussion

O primeiro passo crítico neste protocolo é a preparação de proteínas monoméricas, como no caso da solução aβ 42 descrita nas etapas 1,1 e 1,2. É essencial iniciar o processo de agregação a partir de uma solução monomérica altamente pura, pois a presença de espécies oligoméricas ou agregadas pode resultar em baixa reprodutibilidade da cinética de agregação58e induzir artefatos no AFM medidas (por exemplo, as espécies fibrilares serão evidentes nas fases iniciais da agregaçã…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Swiss National Foundation for Science (SNF) pelo apoio financeiro (Grant Number P2ELP2_162116 e P300P2_171219), o Darwin College, programa Erasmus + para o apoio financeiro (Grant Number 2018-1-LT01-KA103-046719 -15400-P3) e o investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (7. º PQ/2007-2013) através da subvenção do CEI PhysProt (acordo n. º 337969), da Fundação Newman (T.P.J.K.) e da Centro de Cambridge para doenças misfolding (CG, T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001
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Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Chia, S., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60108, doi:10.3791/60108 (2019).
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