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Imunologia e Infecção

ओजोन एक्सपोजर के बाद अल्वेलर मैक्रोफेज एफेरोसाइटोसिस के विवो आकलन में

Published: October 22, 2019
doi:
10.3791/60109
, , ,
1Department of Pharmacology and Toxicology,East Carolina University, 2Research Triangle Park,National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

इस पांडुलिपि ओजोन के संपर्क में, एक मापदंड वायु प्रदूषक के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, विवो में कूपिका मैक्रोफेज efferocysis ख़राब करता है। इस प्रोटोकॉल आमतौर पर इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और तकनीकों का इस्तेमाल करता है और alveolar मैक्रोफेज efferocytosis पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए फुफ्फुसीय चोट के कई मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

ओजोन(ओ3) एक मापदंड वायु प्रदूषक है जो क्रोनिक फुफ्फुसीय रोगों की घटनाओं को बढ़ाता है और बढ़ाता है। हे3 जोखिम फुफ्फुसीय सूजन प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, लेकिन थोड़ा कैसे जोखिम सूजन के संकल्प के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को बदल के बारे में जाना जाता है। एफेरोसाइटोसिस एक संकल्प प्रक्रिया है, जिसके द्वारा मैक्रोफेज फागोसाइटाइज़ एपोप्टोटिक कोशिकाओं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ओ3प्रेरित फेफड़ों की चोट और सूजन के बाद कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis को मापने के लिए है। efferocytosis को मापने के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है; हालांकि, सबसे पूर्व vivo जोड़तोड़ की आवश्यकता है. यहाँ विस्तार से वर्णित एक प्रोटोकॉल है vivo alveolar मैक्रोफेज efferocytosis में मापने के लिए 24 एच के बाद हे3 जोखिम है, जो मैक्रोफेज के पूर्व vivo हेरफेर से बचा जाता है और एक सरल तकनीक है कि सही में perturbations का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है इस समाधान प्रक्रिया. प्रोटोकॉल एक तकनीकी रूप से गैर गहन और अपेक्षाकृत सस्ती विधि है कि पूरे शरीर ओ3 साँस लेना apoptotic कोशिकाओं के oropharyngeal आकांक्षा द्वारा पीछा शामिल है (यानी, Jurkat टी कोशिकाओं) जबकि सामान्य संज्ञाहरण के तहत. अल्वेलर मैक्रोफेज efferocytosis तो ब्रोंकोएल्वेलर (BAL) lavage से एकत्र मैक्रोफेज के प्रकाश माइक्रोस्कोपी मूल्यांकन द्वारा मापा जाता है। Efferocytosis अंत में एक efferocytic सूचकांक की गणना करके मापा जाता है. सामूहिक रूप से, उल्लिखित तरीकों vivo में फेफड़ों में efferocytic गतिविधि मात्रा जबकि भी O3 या अन्य साँस अपमान के नकारात्मक स्वास्थ्य प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए सेवारत.

Introduction

फेफड़े लगातार पर्यावरण के अपमान के संपर्क में है, हवा कण, वायरस, बैक्टीरिया, और ऑक्सीडेंट गैसों है कि फुफ्फुसीय सूजन1,2,3ट्रिगर सहित . ये अपमान गैस विनिमय समझौता कर सकते हैं और अपरिवर्तनीय ऊतक चोट4,5प्रेरित कर सकते हैं . Alveolar मैक्रोफेज, जो लगभग 95% प्रतिरक्षा कोशिकाओं का गठन murine और homeostasis में मानव फेफड़ों में पाया, पर्यावरण अपमान के बाद फुफ्फुसीय सूजन के महत्वपूर्ण नियामकों रहे हैं1,2, 3,4,5. अल्वेओलर मैक्रोफेज पोजासाइटीकरण और रोगजनकों को नष्ट करके मेजबान रक्षा के दौरान आवश्यक हैं। हाल ही में, कूपिका मैक्रोफेज को ऊतक होमोस्टेसिस को बढ़ावा देने और efferocytosis6,7के माध्यम से सूजन के संकल्प को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है । एफेरोसाइटोसिस एक फागोसाइटिक प्रक्रिया है जिसमें मैक्रोफेज व्याप्त होते हैं और एपोप्टोटिक कोशिकाओं को समाप्त कर देते हैं8,9,10. Efferocytosis भी मध्यस्थों के उत्पादन में परिणाम (यानी, आईएल-10, TGF-जेड, पीजीई2, और नाइट्रिक ऑक्साइड) कि आगे की प्रक्रिया में वृद्धि, सूजन के संकल्प में जिसके परिणामस्वरूप9,10,11 ,12,16,18. यह प्रक्रिया द्वितीयक नेक्रोसिस को रोकने और ऊतक होमेंटासिस12,13,14को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक है . कई अध्ययनों से अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज और अज्ञातहेतुक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस8,9,15सहित विभिन्न पुरानी फेफड़ों की बीमारियों के साथ बिगड़ा efferocytosis जुड़ा हुआ है, 16,17.

हे3 एक मापदंड वायु प्रदूषक है जो पुरानी फुफ्फुसीय रोगों की घटनाओं को बढ़ाता है और19,20,21को बढ़ाता है . हे3 फुफ्फुसीय सूजन और चोट पैदा करता है और जीवाणु रोगजनकों के अल्वेलर मैक्रोफेज फागोसाइटोसिस को बाधित करने के लिए जाना जाता है22,23. तथापि, यह अज्ञात है कि क्या हे3 कूपक प्रोसेरोसाइटोसिस को बाधित करता है। जांच हे3-प्रेरित कूपिका efferocytosis में परिवर्तन कैसे जोखिम पुरानी फुफ्फुसीय रोग घटना और उत्तेजना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं में संभावित अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. नीचे वर्णित तीव्र ओ3 जोखिम के बाद मादा चूहों के फेफड़ों में कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल तरीका है।

रेखांकित विधि आमतौर पर महंगा फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग को नष्ट करने से क्षेत्र में इस्तेमाल किया अन्य efferocytosis प्रोटोकॉल पर कई फायदे posseses, व्यापक प्रवाह साइटोमेट्री माप, और कूपिका मैक्रोफेज के पूर्व vivo हेरफेर24 ,25. इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल फेफड़ों के सूक्ष्म पर्यावरण के संदर्भ में कूपिका मैक्रोफेज efferocytosis को मापता है, जो मैक्रोफेज फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकता है।

Protocol

सभी तरीकों को पूर्वी कैरोलिना विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है. 1. ओजोन(ओ3) और फ़िल्टर्ड हवा जोखिम (दिन 1) एक स्टील पिंजरे में 12 महिला C57BL/…

Representative Results

हे3 जोखिम फुफ्फुसीय सूजन और चोट प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, और efferocytosis ऊतक homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक है। C57BL/6J मादा चूहों को फ़िल्टर्ड हवा (एफए) या 1 पीपीएम ओ3 के लिए 3 एच और नेक्रोप्स…

Discussion

Efferocytosis एक विरोधी भड़काऊ प्रक्रिया है जिसमें मैक्रोफेज स्पष्ट apoptotic कोशिकाओं और मलबे के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों9,10,11,12,<sup cla…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस अध्ययन के स्वास्थ्य प्रभाव संस्थान वाल्टर ए Rosenblith पुरस्कार और NIEHS R01ES028829 (के एम जी के लिए) द्वारा वित्त पोषित है. हम डॉ Dianne वाल्टर्स (शरीर विज्ञान विभाग, ECU) alveolar मैक्रोफेज के प्रतिनिधि चित्र प्राप्त करने के साथ उसकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.
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Keywords: Alveolar MacrophageEfferocytosisOzone ExposureLung InjuryInflammationJurkat T CellsApoptotic CellsUV IrradiationCell CultureIn Vivo Assessment
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Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).
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