En la evaluación Vivo de la efiytosis de macrófagos alveolares tras la exposición al ozono
Summary
Este manuscrito describe un protocolo para determinar si la exposición al ozono, un criterio contaminante del aire, afecta a la eferocítosis in vivo de los macrófagos alveolares. Este protocolo utiliza reactivos y técnicas de uso común y se puede adaptar a múltiples modelos de lesión pulmonar para determinar los efectos sobre la eferocittosis de macrófagos alveolares.
Abstract
El ozono (O3)es un contaminante del aire criterio que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas. Se sabe que la exposición a O3 induce inflamación pulmonar, pero se sabe poco con respecto a cómo la exposición altera los procesos importantes para la resolución de la inflamación. La efferocitasis es un proceso de resolución, mediante el que los macrófagos fagocytizan las células apoptóticas. El propósito de este protocolo es medir la eferocitis de los macrófagos alveolares después de la lesión pulmonar inducida por O3y la inflamación. Se han descrito varios métodos para medir la eferocitosis; sin embargo, la mayoría requieren manipulaciones ex vivo. Aquí se describe en detalle un protocolo para medir la efistosis de macrófagos alveolares in vivo 24 h después de la exposición a O3, que evita la manipulación ex vivo de los macrófagos y sirve como una técnica simple que se puede utilizar para perturbar con precisión las representaciones en este proceso de resolución. El protocolo es un método técnicamente no intensivo y relativamente barato que implica inhalación de O3 de todo el cuerpo seguida de la aspiración orofaríngea de células apoptóticas (es decir, células T Jurkat) mientras está bajo anestesia general. La eferocitosis de macrófagos alveolares se mide entonces mediante la evaluación por microscopía de luz de macrófagos recogidos del lavado broncoalveolar (BAL). La eferocítis finalmente se mide calculando un índice efferocítico. Colectivamente, los métodos descritos cuantifican la actividad efferocí en el pulmón in vivo mientras que también sirven para analizar los efectos negativos para la salud de O3 u otros insultos inhalados.
Introduction
El pulmón está constantemente expuesto a insultos ambientales, incluyendo partículas de aire, virus, bacterias y gases oxidantes que desencadenan inflamación pulmonar1,2,3. Estos insultos pueden comprometer el intercambio de gas e inducir lesiones de tejidoirreversibles 4,5. Los macrófagos alveolares, que constituyen aproximadamente el 95% de las células inmunitarias que se encuentran en los pulmones murinos y humanos en la homeostasis, son reguladores críticos de la inflamación pulmonar después de los insultos ambientales1,2, 3,4,5. Los macrófagos alveolares son esenciales durante la defensa del huésped al fagocica y eliminando patógenos. Recientemente, se ha demostrado que los macrófagos alveolares promueven la homeostasis tisular y la resolución de la inflamación a través de la eferocitosis6,7. La efferocitasis es un proceso fagocítico en el que los macrófagos envuelven y eliminan las células apoptóticas8,9,10. La eferocitosis también da lugar a la producción de mediadores (es decir, IL-10, TGF-, PGE2y óxido nítrico) que aumentan aún más el proceso, lo que resulta en la resolución de la inflamación9,10,11 ,12,16,18. Este proceso es necesario para prevenir la necrosis secundaria y promover la homeostasis tisular12,13,14. Varios estudios han relacionado la insuficiencia efefitosis con diversas enfermedades pulmonares crónicas, incluyendo asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y fibrosis pulmonar idiopática8,9,15, 16,17.
O3 es un criterio contaminante del aire que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas19,20,21. O3 induce inflamación pulmonar y lesión y se sabe que afecta la fagocitosis de los patógenos bacterianos22,23. Sin embargo, se desconoce si O3 afecta a la eferocitosis de macrófagos alveolares. La investigación de alteraciones inducidas por O3en la eferocitais de macrófagos alveolares proporcionará una visión potencial de cómo la exposición puede conducir a la incidencia y exacerbación de enfermedades pulmonares crónicas. A continuación se describe un método sencillo para evaluar la eferocítosis de macrófagos alveolares en los pulmones de ratones hembras después de la exposición aguda a O3.
El método esbozado posee varias ventajas sobre otros protocolos de efferocittosis comúnmente utilizados en el campo al eliminar el uso de costosos colorantes fluorescentes, mediciones extensas de citometría de flujo y manipulación ex vivo de macrófagos alveolares24 ,25. Además, este protocolo mide la eferocítis de macrófagos alveolares en el contexto del microambiente pulmonar, que puede influir en la función de los macrófagos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La eferocitosis es un proceso antiinflamatorio en el que los macrófagos limpian las células apoptoticas y los desechos, así como producen múltiples mediadores antiinflamatorios9,10,11,12,16 ,18. Múltiples modelos de efferocittosis han proporcionado información sobre cómo el macrófago es una célula crítica en la res…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio está financiado por el Instituto de Efectos para la Salud Walter A. Rosenblith Award y NIEHS R01ES028829 (a K. M. G). Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Dianne Walters (Departamento de Fisiología, ECU) por su ayuda para obtener imágenes representativas de los macrófagos alveolares.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
Referências
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O’Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
