세포 표현형 및 분비 특성화를 위한 인간 지방 조직 미세 단편화
Summary
여기서, 우리는 폐쇄된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직 효소-무마이크로 단편화를 제시한다. 이 새로운 방법은 생체 내 이식, 시험관 내 배양, 및 추가적인 세포 격리 및 특성화에 적합한 지방 조직의 서브 밀리미터 클러스터의 획득을 허용한다.
Abstract
지난 10 년 동안, 지방 조직 이식 널리 조직 재생 및 / 또는 재생을 향상시키기 위해 성형 수술 및 정형 외과에 사용되어왔다. 따라서, 인간 지방 조직을 수확하고 가공하는 기술은 다량의 조직을 신속하고 효율적으로 얻기 위해 진화했다. 이 중, 폐쇄 시스템 기술은 수확, 처리, 짧은 시간에 동일한 개입 (수술 중)에서 정제 된 지방 조직을 다시 주입하는 혁신적이고 사용하기 쉬운 시스템을 나타냅니다. 지방 조직은 지방 흡입에 의해 수집, 세척, 유화, 헹구고 0.3 에 0.8 mm의 세포 클러스터로 기계적으로 다진. 기계적으로 단편화 된 지방 조직의 자가 이식은 다른 치료에서 현저한 효능을 보였다 미용 의학 및 수술, 정형 외과 및 일반 수술과 같은 적응증. 미세 단편화 된 지방 조직의 특성화는 지방 세포 클러스터 내에서 손상되지 않은 작은 혈관의 존재를 밝혀; 따라서, 시반 틈새 는 흔들리지 않는 남아있다. 이들 군집은 혈관세포(즉, 중간엽 줄기세포(MSC) 조상)에서 풍부하게 공급되고 시험관내 분석은 효소 유래 중간엽 세포에 비해 조직 수선 및 재생에 관여하는 성장 인자 및 사이토카인의 증가된 방출을 보였다. 이것은 미세 단편화된 지방 조직의 우수한 치료 잠재력이 추정 형 MCS및 향상된 분비 활성의 높은 빈도에 의해 설명된다는 것을 시사한다. 이들 첨가된 pericytes가 더 높은 성장 인자 및 사이토카인 생산에 직접적으로 기여하는지 여부는 알려져 있지 않다. 이 임상적으로 승인된 절차는 확장 및/또는 효소 치료없이 추정 형 MC의 이식을 허용하여 GMP 지침의 요구 사항을 우회하고 세포 기반 치료 비용을 줄일 수 있습니다.
Introduction
회당 조직은 오랫동안 재건 및 성형 수술에서 필러로 사용되어 왔으며, 최근에는 중간엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 공급원으로 인식된 재생 의학에서 더 인기를 얻고 있습니다1. 지질흡사염은 단세포 현탁액으로 효소해리되어 환자에서 변경되지 않은 채 사용되거나, 더 일반적으로, MSCs2로몇 주 동안 배양되는 지방세포없는 기질 혈관 분획(SVF)을 산출한다.
그러나, 효소 해리는 시험관 내 문화에 의해 상당히 변형되는 추정 재생 세포로부터 인접한 조절 세포를 외딴 조직 미세 환경을 파열시킵니다. 이러한 실험적 유물 및 그에 따른 기능적 변경을 피하기 위해,가능한한 기본 구성을 그대로 유지하면서 치료용 지방 조직을 처리하려는 시도가3,4. 특히, 기계적 조직 파괴는 효소 해리를 대체하기 시작했습니다. 이를 위해, 완전 침지 폐쇄 시스템은 체 여과 및 강철 대리석 유도중단의서열을 통해 서브 밀리미터, 혈액 및 오일 프리 조직 클러스터(예를 들어, Lipogems)로 리포아스해적을 밀어넣는다 3. 이 폐쇄 된 시스템 기술을 사용하여 마이크로 단편화 된 지방 조직의 자가 이식은 화장품, 정형 외과, 진록학 및부인과에걸쳐 여러 적응증에 성공했습니다 4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
폐쇄 된 시스템 장치와 등소 성 SVF로 얻은 인간 미세 단편 지방 조직 (MAT)과의 비교는 혈관 / 기질 세포 분포 및 배양내분비 활성과 관련하여 MAT가 더 많은 pericytes를 함유하고 있음을 밝혀냈습니다. 추정형자엽(14)과더 많은 양의 성장인자와 사이토카인(15)을 분비한다.
본 논문은 폐쇄된 시스템 장치를 이용한 인간 피하 지방 조직의 효소 프리 미세 단편화, 체외 배양, 면역조직화학 및 FACS 분석을 위한 이러한 미세화된 지방 조직의 추가 처리를 도시하고, 현재 존재하는 세포 유형과 분비되는 수용성 인자를 식별하기 위해(그림 1). 기재된 방법은 자연 틈새 시장에서 생존 가능한 지방 조직 세포 집단을 포함하는 지방 유래 서브 밀리미터 오르가노이드를 안전하게 생성하며, 추가 의 응용 및 연구에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 폐쇄 된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직을 정상적인 지방 조직 미세 해부학을 나타내는 작은 클러스터로 물리적 분획에 대해 설명합니다.
수동으로 흡인 된 인간 피하 지방 조직 과 식염수 용액은 장치의 격렬한 수동 흔들림시 지방을 밀리미터 단위로 파열시키는 큰 핀볼 스타일의 금속 구체가 들어있는 투명한 플라스틱 실린더에 로드됩니다. 조각. 부착된…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 플로우 세포 측정에 대한 전문가의 도움을 에든버러 대학에서 클레어 크라이어와 피오나 로시에게 감사하고 자합니다. 우리는 또한 조직 표본을 제공함으로써 기여 머레이 필드 병원의 직원에게 감사드립니다.
이 작품은 지방 조직 처리 키트를 공급 영국 심장 재단과 Lipogems에서 보조금에 의해 지원되었다. 인간 성인 조직 샘플은 동남 스코틀랜드 연구 윤리위원회의 완전한 윤리 허가로 조달되었습니다 (참조: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
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