細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化
Summary
ここでは、閉じたシステム装置を用いて酵素フリーの微細断片化をヒト脂肪組織に提示する。この新しい方法は、生体内移植、インビトロ培養、およびさらなる細胞単離および特性化に適した脂肪組織のサブミリメートルクラスターの取得を可能にする。
Abstract
過去10年間、脂肪組織移植は、組織の再生および/または再生を強化するために、整形外科や整形外科で広く使用されてきました。したがって、ヒト脂肪組織を採取・処理する技術は、大量の組織を迅速かつ効率的に得るために進化してきた。これらの中で、クローズドシステム技術は、短時間で同じ介入(術中)で精製された脂肪組織を収穫、処理、再注入する革新的で使いやすいシステムを表します。脂肪組織は脂肪吸引によって採取され、洗浄され、乳化され、0.3~0.8mmの細胞クラスターに機械的にすすり込まれ、みじん切り.機械的に断片化された脂肪組織の自家移植は、異なる治療において顕著な有効性を示した。美容医学や手術、整形外科、一般的な手術などの適応症。微細断片化脂肪組織の特徴付けは、脂肪細胞クラスター内の無傷の小さな血管の存在を明らかにした。したがって、血管部膜のニッチは動揺しないままにされる。これらのクラスターは、血管細胞(すなわち、間葉系幹細胞(MSC)の祖先)に富み、インビトロ分析では、酵素的に由来するMSCと比較して、組織の修復および再生に関与する成長因子およびサイトカインの放出が増加したことを示した。これは、微細断片化された脂肪組織の優れた治療可能性が推定MSCのより高い頻度および増強された分泌活性によって説明されたことを示唆する。これらの添加されたペリサイトが高成長因子およびサイトカイン産生に直接寄与するかどうかは知られていない。この臨床的に承認された手順により、拡張および/または酵素治療を必要とせずに推定MSCを移植できるため、GMPガイドラインの要件を回避し、細胞ベースの治療のコストを削減できます。
Introduction
脂肪組織は、再建および美容手術の充填剤として長く使用され、最近では間葉系幹細胞(MSC)1の供給源として認識された再生医療においてより一般的になってきている。単細胞懸濁液を単細胞懸濁液に解離すると、患者に変わらず使用される脂肪細胞フリー間質血管画分(SVF)を得るか、より一般的には、MSC2に数週間培養される。
しかし、酵素解離は組織微小環境を破裂させ、インビトロ培養によってかなり修飾される推定再生細胞から隣接する調節細胞を隔離する。このような実験的なアーティファクトおよび結果的な機能的変化を避けるために、可能な限りそのネイティブ構成をそのまま維持しながら、治療用の脂肪組織を処理する試みがなされている3,4。特に、機械的組織の破壊は酵素解離に取って代わり始めている。この目的のために、完全な浸漬閉塞系マイクロフラグメントリポアスは、サブミリメートル、血液および無油組織クラスター(例えば、リポゲム)にふるい質濾過および鋼大理石誘発破壊3のシーケンスを介して、マイクロ断片化脂肪組織の自家移植は、この閉じたシステム技術を使用して、複数の適応症、化粧品、整形外科、直腸および婦人科4、5、複数の適応症で成功している。6,7,8,9,10,11,12,13.
閉じたシステム装置と同位体SVFで得られたヒト微細断片脂肪組織(MAT)との比較は、血管/間質細胞分布および培養中の分泌活性に関して、MATはより多くのペリサイトを含有することを明らかにした。推定MSC14、および成長因子およびサイトカイン15のより高い量を分泌する。
本記事は、閉じたシステム装置を用いたヒト皮下脂肪組織の酵素フリー微小断片化、及びインビトロ培養用微小化脂肪組織のさらなる処理、免疫組織化学およびFACS分析、存在する細胞型と分泌される可溶性因子を同定するために(図1)。記載された方法は、生存可能な脂肪組織細胞集団を含む脂肪由来のサブミリメートルオルガノイドを無傷のニッチで安全に生成し、さらなる応用および研究に適している。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、閉じたシステム装置を用いて、正常な脂肪組織微小解剖学を示す小さなクラスターにヒト脂肪組織の物理的分画について説明する。
手動吸引ヒト皮下脂肪組織および生理液は、装置の激しい手動振盪の際に、脂肪をサブミリメートルに破裂させる大きなピンボールスタイルの金属球を含む透明なプラスチックシリンダーにロードされるフラグメント。付属?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、エジンバラ大学のクレア・クライアーとフィオナ・ロッシに、フローサイトメトリーの専門家の支援に感謝したいと考えています。また、組織標本の提供に貢献したマレーフィールド病院の職員に感謝します。
この研究は、脂肪組織処理キットを提供した英国心臓財団とリポゲムズからの助成金によって支えられました。ヒト成人組織サンプルは、南東スコットランド研究倫理委員会の完全な倫理許可を得て調達された(参照:16/SS/0103)。
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
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