Human fettvävnad mikro-fragmentering för cell fenotypning och Secretome karakterisering
Summary
Här presenterar vi Human fettvävnad enzym-fri mikro-fragmentering med hjälp av en sluten system enhet. Denna nya metod gör det möjligt att obtainmenten av sub-millimeter kluster av fettvävnad som lämpar sig för in vivo transplantation, in vitro-kultur, och ytterligare cell isolering och karakterisering.
Abstract
Under det senaste decenniet har fettvävnad transplantationer använts i stor utsträckning i plastikkirurgi och ortopedi för att förbättra vävnad tillskott och/eller förnyelse. Följaktligen, tekniker för skörd och bearbetning av mänskliga fettvävnad har utvecklats för att snabbt och effektivt få stora mängder vävnad. Bland dessa, den slutna systemteknik representerar en innovativ och lätt att använda system för att skörda, bearbeta, och åter injicera raffinerad fettvävnad på kort tid och i samma intervention (Intra-operativt). Fettvävnad samlas in genom fettsugning, tvättad, emulgerade, sköljas och mals mekaniskt till cell kluster på 0,3 till 0,8 mm. autolog transplantation av mekaniskt fragmenterad fettvävnad har visat anmärkningsvärd effekt vid olika terapeutiska indikationer såsom estetisk medicin och kirurgi, ortopediska och allmän kirurgi. Karakterisering av mikro-fragmenterad fettvävnad avslöjade närvaron av intakt små fartyg inom fettceller-kluster; Därför är perivaskulär nisch kvar unperturbed. Dessa kluster är berikade i perivaskulära celler (dvs., mesenkymala stamceller (MSC) förfäder) och in vitro-analys visade en ökad frisättning av tillväxtfaktorer och cytokiner inblandade i vävnad reparation och förnyelse, jämfört med enzymatiskt härledda MSCs. Detta tyder på att den överlägsna terapeutiska potentialen av mikrofragmenterad fettvävnad förklaras av en högre frekvens av presumtiva MSCs och förbättrad sekretorisk aktivitet. Om dessa extra pericyter direkt bidrar till högre tillväxtfaktor och cytokin produktion är inte känd. Detta kliniskt godkända förfarande möjliggör transplantation av presumtiva MSCs utan behov av expansion och/eller enzymatisk behandling, vilket kringgår kraven i GMP-riktlinjer och sänker kostnaderna för cellbaserade terapier.
Introduction
Fettvävnad, länge används som fyllmedel i rekonstruktiv och kosmetisk kirurgi, har nyligen blivit mer populär i regenerativ medicin en gång erkänd som en källa för mesenkymala stamceller (MSCs)1. Lipoaspirates dissocierade enzymatiskt till encelliga suspensioner ger en adipocyte-fri stromacellstumörer vaskulär fraktion (SVF) som används oförändrat i patienten eller, oftare, odlas i flera veckor i MSCs2.
Men, enzym dissociation spricker vävnaden mikromiljöer, avskildhet angränsande reglerande celler från presumtiva regenerativa celler som blir avsevärt ändras genom in vitro-kultur. För att undvika sådana experimentella artefakter och därav funktionella förändringar, försök har gjorts för att bearbeta fettvävnad för terapeutiskt bruk samtidigt som den ursprungliga konfigurationen så intakt som möjligt3,4. I synnerhet har mekaniska vävnads störningar börjat ersätta enzymatisk dissociation. För detta ändamål, hela nedsänkning slutna systemet mikro-fragment lipoaspirates i sub-millimeter, blod-och oljefri vävnad kluster (t. ex., Lipogems) via en sekvens av SIL filtrering och stål marmor inducerad störningar3. Autolog transplantation av mikro-fragmenterad fettvävnad, med hjälp av denna slutna systemteknik, har varit framgångsrik i flera indikationer, spänner kosmetika, ortopedi, proktologi och gynekologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Jämförelse mellan humant mikrofragmenterad fettvävnad (Matt) som erhållits med den slutna systemenheten och ISOGEN SVF visade att med avseende på vaskulär/stromalcellsdistribution och sekretorisk aktivitet i kulturen innehåller MAT mer pericyter, som presumtiva MSCs14, och utsöndrar högre halter av tillväxtfaktorer och cytokiner15.
Den nuvarande artikeln illustrerar enzymet-fri mikro-fragmentering av mänskliga subkutan fettvävnad med hjälp av en sluten system enhet, och ytterligare bearbetning av sådana mikroniserade fettvävnad för in vitro-kultur, immunohistokemi och FACS analys, för att identifiera de celltyper som finns och de lösliga faktorerna som utsöndras (figur 1). Den beskrivna metoden genererar säkert fett härledda sub-millimeter organoider som innehåller livskraftiga fettvävnad cellpopulationer i en intakt nisch, lämplig för ytterligare tillämpningar och studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna uppsats beskriver den fysiska fraktionering, med hjälp av en sluten system enhet, av mänsklig fettvävnad i små kluster som visar normal fettvävnad mikroanatomi.
Manuellt aspirrankade mänskliga subkutana fettvävnad och saltlösning lastas i en genomskinlig plast cylinder som innehåller stora Flipper-stil metalliska sfärer som, vid kraftig manuell skakning av anordningen, bristning fettet i sub-millimeter Fragment. Bifogade filter och utlopp gör det möjligt att eliminera skräp,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Claire Cryer och Fiona Rossi vid universitetet i Edinburgh för deras experthjälp med Flow cytometry. Vi vill också tacka Personalen på Murrayfield Hospital som bidrog genom att tillhandahålla vävnadsprover.
Detta arbete stöddes av bidrag från British Heart Foundation och Lipogems, som levererade fettvävnad bearbetning kit. Prover på human vävnad från vuxna har anskaffats med full etik behörighet från forskningsetiska kommittén i sydöstra Skottland (referens: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- . Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
