الانسجه الدهنية البشرية التجزئة الصغرى لتوصيف الخلية وخصائص الإفراز
Summary
هنا ، ونحن نقدم الإنسان الانسجه الدهنية خاليه من انزيم التجزئة الصغيرة باستخدام جهاز مغلق النظام. هذه الطريقة الجديدة تسمح لحصول علي من مجموعات المليمتر من الانسجه الدهنية المناسبة في زرع الجسم المجري, في المختبر الثقافة, والمزيد من العزلة الخلية وتوصيف.
Abstract
في العقد الماضي ، كانت عمليات زرع الانسجه الدهنية تستخدم علي نطاق واسع في الجراحة التجميلية وتقويم العظام لتعزيز أعاده الانسجه و/أو التجدد. وبناء علي ذلك ، تطورت تقنيات حصاد ومعالجه الانسجه الدهنية البشرية من أجل الحصول بسرعة وكفاءه علي كميات كبيره من الانسجه. ومن بين هذه التقنيات ، تمثل تكنولوجيا النظام المغلق نظاما مبتكرا وسهل الاستخدام لحصاد الانسجه الدهنية المكررة ومعالجتها وأعاده حقنها في وقت قصير وفي نفس التدخل (داخل العملية). يتم جمع الانسجه الدهنية عن طريق شفط الدهون ، وغسلها ، مستحلب ، شطف ومفروم ميكانيكيا في مجموعات الخلايا من 0.3 إلى 0.8 مم. وقد أظهرت الذاتي زرع الانسجه الدهنية مجزاه ميكانيكيا فعاليه ملحوظة في مختلف العلاجية مؤشرات مثل الطب التجميلي والجراحة ، والعظام والجراحة العامة. وكشف توصيف الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا عن وجود السفن الصغيرة السليمة داخل مجموعات الخلايا الشحمية ؛ التالي ، ترك مشكاة الاوعيه الدموية غير مضطرب. وقد أثريت هذه التكتلات في خلايا الاوعيه الدموية (اي أسلاف الخلايا الجذعية (MSC)) واظهر التحليل في المختبر زيادة في الإفراج عن عوامل النمو والخلوية المشاركة في إصلاح الانسجه وتجديدها ، بالمقارنة مع MSCs انزيمي المشتقة. وهذا يوحي بان الإمكانات العلاجية المتفوقة للانسجه الدهنية المجزاه تفسر بتردد اعلي من MSCs المفترض والنشاط سيكريتوري المحسنة. وما إذا كانت هذه الإضافات المضافة تساهم مباشره في زيادة عامل النمو ولا يعرف إنتاج السايسيسين. يسمح هذا الاجراء الذي تمت الموافقة عليه سريريا بزرع MSCs المفترض دون الحاجة إلى التوسع و/أو العلاج الانزيمي ، التالي تجاوز متطلبات GMP المبادئ التوجيهية ، والحد من تكاليف العلاجات القائمة علي الخلايا.
Introduction
الانسجه الدهنية ، وتستخدم لفتره طويلة كحشو في الجراحة الترميمية والتجميلية ، وقد أصبحت في الاونه الاخيره أكثر شعبيه في الطب التجديدي المعترف بها مره واحده كمصدر للخلايا الجذعية المسسبي (MSCs)1. الدهون الانزيميه المنفصلة في المعلقات أحاديه الخلية تسفر عن كسر الاوعيه الدموية اللحمية الخالية من الخلايا الشحمية (SVF) التي يتم استخدامها دون تغيير في المريض أو ، أكثر شيوعا ، يتم استزراعها لعده أسابيع في MSCs2.
ومع ذلك ، تفكك الانزيم تمزق بيئات الانسجه الصغرى ، عزله الخلايا التنظيمية المجاورة من الخلايا التجديدية المفترضة التي تصبح تعديلا كبيرا من قبل في المختبر الثقافة. لتجنب مثل هذه التحف التجريبية والتعديلات الوظيفية المترتبة علي ذلك ، بذلت محاولات لمعالجه الانسجه الدهنية للاستخدام العلاجي مع الحفاظ علي تكوينها الأصلي كما سليمه قدر الإمكان3،4. وعلي وجه الخصوص ، بدات اضطرابات الانسجه الميكانيكية لتحل محل التفكك الانزيمي. وتحقيقا لهذه الغاية ، الغمر الكامل مغلقه نظام الأجزاء الصغيرة الدهنية في الخلايا الفرعية ملليمتر ، والدم والنفط خاليه من مجموعات الانسجه (علي سبيل المثال ، ليبوجواهر) عن طريق سلسله من غربال الترشيح والرخام الصلب الناجم عن انقطاع3. الزرع الذاتي للانسجه الدهنية المجزاه جزئيا ، باستخدام هذه التكنولوجيا المغلقة للنظام ، كان ناجحا في مؤشرات متعددة ، والتي تغطي مستحضرات التجميل ، وجراحه العظام ، وطب المستقيم وامراض النسائية4،5، 6،7،8،9،10،11،12،13.
وكشفت المقارنة بين الانسجه الدهنية الدقيقة المجزاه البشرية (حصيره) التي تم الحصول عليها مع جهاز النظام المغلق و SVF العصبية انه فيما يتعلق بتوزيع الخلايا الوعائية/اللحمية والنشاط سيكريتوري في الثقافة ، حصيره يحتوي علي المزيد من بيريسيلات ، والتي هي المفترض MSCs14، ويفرز كميات اعلي من عوامل النمو و السايتوكينات15.
وتوضح هذه المادة التجزئة الصغرى الخالية من الانزيمات للانسجه الدهنية تحت الجلد البشرية باستخدام جهاز مغلق ، والمزيد من معالجه هذه الانسجه الدهنية المجهرية للثقافة الانبوبيه ، والمناعي ، وتحليل النظام ، من أجل تحديد أنواع الخلايا الموجودة والعوامل القابلة للذوبان التي يفرزها (الشكل 1). الطريقة الموصوفة بأمان يولد الدهنية المشتقة من الملليمتر العضوي الذي يحتوي علي خلايا الانسجه الدهنية قابله للحياة في مكانه سليمه ، ومناسبه لمزيد من التطبيقات والدراسات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الورقة التجزئة الفيزيائية ، باستخدام جهاز مغلق ، من الانسجه الدهنية البشرية إلى مجموعات صغيره تعرض التشريح المجهري للانسجه الدهنية العادية.
يتم تحميل الانسجه الدهنية تحت الجلد الإنسان يدويا ومحلول ملحي في اسطوانه بلاستيكية شفافة تحتوي علي الكرات المعدنية الكبيرة…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون ان يشكروا كلير كراير وفيونا روسي في جامعه ادنبره علي مساعدتهم الخبيرة في قياس التدفق الخلوي. ونود أيضا ان نشكر موظفي مستشفي موراريفيلد الذين ساهموا في تقديم عينات من الانسجه.
وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مؤسسه القلب البريطانية والأحجار الكريمة ، التي زودت مجموعات تجهيز الانسجه الدهنية. وتم شراء عينات من انسجه الكبار البشرية باذن أخلاقي كامل من لجنه الأخلاقيات البحثية في جنوب شرق اسكتلندا (المرجع: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- . Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
