Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l’ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l’ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.
Nell’ultimo decennio, i trapianti di tessuto adiposo sono stati ampiamente utilizzati nella chirurgia plastica e nell’ortopedia per migliorare la riproduzione e/o la rigenerazione dei tessuti. Di conseguenza, le tecniche per la raccolta e la lavorazione del tessuto adiposo umano si sono evolute al fine di ottenere rapidamente ed efficientemente grandi quantità di tessuto. Tra questi, la tecnologia del sistema chiuso rappresenta un sistema innovativo e facile da usare per raccogliere, elaborare e reiniettare tessuto adiposo raffinato in breve tempo e nello stesso intervento (intraoperatorio). Il tessuto adiposo viene raccolto mediante liposuzione, lavato, emulsionato, sciacquato e sciacquato meccanicamente in grappoli cellulari da 0,3 a 0,8 mm. Il trapianto autologo di tessuto adiposo frammentato meccanicamente ha dimostrato una notevole efficacia in diverse terapie terapeutiche come la medicina estetica e la chirurgia, la chirurgia ortopedica e generale. La caratterizzazione del tessuto adiposo micro-frammentato ha rivelato la presenza di piccoli vasi intatti all’interno degli ammassi adipociti; quindi, la nicchia perivascolare rimane imperturbata. Questi ammassi sono arricchiti in cellule perivascolari (ad esempio, antenati delle cellule staminali mesenchymal (MSC)) e l’analisi in vitro ha mostrato un maggiore rilascio di fattori di crescita e citochine coinvolte nella riparazione e rigenerazione dei tessuti, rispetto alle MSC di degenerazione enzimaticamente. Ciò suggerisce che il potenziale terapeutico superiore del tessuto adiposo microframmentato è spiegato da una maggiore frequenza di MSC presuntivi e una maggiore attività secretoria. Non è noto se questi periciti aggiunti contribuiscano direttamente a un fattore di crescita più elevato e alla produzione di citochine. Questa procedura clinicamente approvata consente il trapianto di sOTT SONdativi senza la necessità di espansione e/o trattamento enzimatico, aggirando così i requisiti delle linee guida GMP e riducendo i costi per le terapie basate sulle cellule.
Tessuto adiposo, a lungo utilizzato come riempitivo in chirurgia ricostruttiva e estetica, è recentemente diventato più popolare nella medicina rigenerativa una volta riconosciuto come fonte per le cellule staminali mesenchymiche (MSC)1. I lipoaspirati dissociati enzimati in sospensioni unicellulari producono una frazione vascolare stromale senza adipociti (SVF) che viene utilizzata inalterata nel paziente o, più comunemente, viene coltivata per diverse settimane in MSC2.
Tuttavia, la dissociazione enzimatica rompe i microambienti tissutali, appartando le cellule regolatorie vicine da cellule rigenerative presunte che diventano notevolmente modificate dalla coltura in vitro. Per evitare tali artefatti sperimentali e conseguenti alterazioni funzionali, sono stati fatti tentativi di elaborare il tessuto adiposo per uso terapeutico, pur mantenendo la sua configurazione nativa il più intatta possibile3,4. In particolare, l’interruzione meccanica dei tessuti ha iniziato a sostituire la dissociazione enzimatica. A tal fine, la full immersion ha chiuso i micro-frammenti di micro-frammenti lipoaspirati in sottomillimetri, cluster di tessuti privi di sangue e olio (ad esempio, Lipogems) attraverso una sequenza di filtrazione setaccio e marmo d’acciaio indotto interruzione3. Il trapianto autologo di tessuto adiposo micro-frammentato, utilizzando questa tecnologia di sistema chiuso, ha avuto successo in molteplici indicazioni, estendendo cosmetici, ortopedici, proctologia e ginecologia4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Il confronto tra il tessuto adipose umano microframmentato (MAT) ottenuto con il dispositivo di sistema chiuso e la SVF isogenica ha rivelato che per quanto riguarda la distribuzione delle cellule vascolari/stromali e l’attività secretoria nella coltura, il MAT contiene più periciti, che sono presuntistativi MSC14, e secerne maggiori quantità di fattori di crescita e citochine15.
Il presente articolo illustra la microframmentazione senza enzimi del tessuto adiposo sottocutaneo umano utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, e l’ulteriore elaborazione di tale tessuto adiposo micronizzato per la coltura in vitro, l’immunohistochimica e l’analisi FACS, per identificare i tipi di cellule presenti e i fattori solubili secreti (Figura 1). Il metodo descritto genera in modo sicuro organoidi sub-millimeter derivati adiposi contenenti popolazioni di cellule adipose vitali in una nicchia intatta, adatta per ulteriori applicazioni e studi.
Questo documento descrive la frazione fisica, utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, del tessuto adiposo umano in piccoli ammassi che mostrano la normale microanatomia del tessuto adiposo.
Il tessuto adipose umano aspirato manualmente e la soluzione salina vengono caricati in un cilindro di plastica trasparente contenente grandi sfere metalliche in stile flipper che, a forte agitazione manuale del dispositivo, rompono il grasso in sub-millimetri Frammenti. I filtri attaccati e le slet c…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Claire Cryer e Fiona Rossi dell’Università di Edimburgo per la loro assistenza esperta con citometria di flusso. Desideriamo anche ringraziare il personale dell’ospedale Murrayfield che ha contribuito fornendo campioni di tessuto.
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della British Heart Foundation e Lipogems, che hanno fornito kit di lavorazione dei tessuti adiposi. Campioni di tessuto umano adulto sono stati acquistati con il pieno permesso etico del Comitato etico di ricerca del Sud Est Scozia (riferimento: 16/SS/0103).
4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |