Человек жировой ткани микро-фрагментации для клеточного фенотипирования и секретома характеристики
Summary
Здесь мы представляем микрофрагментацию жировой ткани человека без микрофрагментации с помощью закрытого системного устройства. Этот новый метод позволяет получить субмиллиметровые кластеры жировой ткани, пригодные для трансплантации in vivo, культуры in vitro, а также дальнейшей изоляции клеток и характеристик.
Abstract
В последнее десятилетие, жировые пересадки тканей были широко использованы в пластической хирургии и ортопедии для повышения истощения тканей и / или регенерации. Соответственно, методы сбора и обработки жировой ткани человека эволюционировали для того, чтобы быстро и эффективно получать большое количество тканей. Среди них технология закрытой системы представляет собой инновационную и простую в использовании систему сбора, обработки и повторной инъекции рафинированной жировой ткани за короткое время и в рамках того же вмешательства (внутриоперативно). Адипоза собирается путем липосакции, промывают, эмульгируют, промывают и измельчаются механически в клеточные кластеры от 0,3 до 0,8 мм. Автологическая трансплантация механически фрагментированной жировой ткани показала замечательную эффективность в различных терапевтических кластерах такие показания, как эстетической медицины и хирургии, ортопедической и общей хирургии. Характеристика микрофрагментированной жировой ткани выявила наличие нетронутых мелких сосудов в адипоцитных кластерах; следовательно, периваскулярная ниша остается невозмутимым. Эти кластеры обогащаются в периваскулярных клетках (т.е. предках мезенхимальных стволовых клеток (MSC) и in vitro анализ показал повышенное высвобождение факторов роста и цитокинов, участвующих в восстановлении и регенерации тканей, по сравнению с ферментативно полученными МСК. Это говорит о том, что превосходный терапевтический потенциал микрофрагментированной жировой ткани объясняется более высокой частотой предполагаемых МСК и повышенной секреторной активностью. Вносят ли эти добавленные перициты непосредственно более высокий фактор роста и производство цитокинов, неизвестно. Эта клинически утвержденная процедура позволяет трансплантации предполагаемых MSCs без необходимости расширения и / или ферментативного лечения, таким образом, в обход требований Руководящих принципов GMP, и снижение расходов на клеточной терапии.
Introduction
Адипоза ткани, давно используется в качестве наполнителя в реконструктивной и косметической хирургии, в последнее время стал более популярным в регенеративной медицине, когда-то признан в качестве источника мезенхимальных стволовых клеток (MSCs)1. Lipoaspirates диссоциированных ферментативно в одноклеточных суспензий дают адипоцитов свободной стромальной сосудистой фракции (SVF), который используется без изменений в пациента или, чаще всего, культивируется в течение нескольких недель в MSCs2.
Тем не менее, диссоциация ферментов разрывает микроокружение тканей, уединяя соседние регулятивные клетки от предполагаемых регенеративных клеток, которые значительно модифицируются культурой in vitro. Чтобы избежать таких экспериментальных артефактов и последующим функциональным изменениям, были предприняты попытки обработать жировую ткань для терапевтического использования, сохраняя при этом свою родную конфигурацию как можно более нетронутой3,4. Примечательно, что нарушение механической ткани начало заменять ферментативную диссоциацию. С этой целью полное погружение закрытой системы микрофрагментов липоаспирируется в субмиллиметр, кровь и безмасляные тканевые кластеры (например, липогемы) через последовательность фильтрации сито и стального мрамора, индуцированного нарушения3. Автологическая трансплантация микрофрагментированной жировой ткани, используя эту технологию замкнутой системы, была успешной в нескольких показаниях, охватывающих косметику, ортопедию, проктологию и гинекологию4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Сравнение микрофрагментированной жировой ткани человека (MAT), полученной с помощью закрытого системного устройства и изогенного SVF, показало, что в отношении распределения сосудистых/стромальных клеток и секреторной активности в культуре, MAT содержит больше перицитов, которые предполагаемых MSCs14, и выделяет более высокое количество факторов роста и цитокинов15.
В настоящей статье иллюстрируется безферментно-микрофрагментация подкожной жировой ткани человека с помощью закрытого системного устройства, а также дальнейшая обработка такой микронизированной жировой ткани для культуры пробирки, иммуногистохимии и анализа FACS, для того, чтобы определить типы клеток настоящее время и растворимые факторы выделяются (Рисунок 1). Описанный метод безопасно генерирует жировые производные субмиллиметровые органоиды, содержащие жизнеспособные популяции адиповых клеток ткани в нетронутой нише, пригодных для дальнейшего применения и исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описывается физическое фракционирование, с помощью закрытого системного устройства, жировой ткани человека в небольшие кластеры, демонстрирующие нормальную микроанатомию жировой ткани.
Вручную аспирированные человеческие подкожные жировые ткани и соле?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Клэр Крайер и Фиону Росси из Эдинбургского университета за экспертную помощь в цитометрии потока. Мы также хотели бы поблагодарить персонал больницы Мюррейфилд, который внес свой вклад, предоставив образцы тканей.
Эта работа была поддержана грантами Британского фонда сердца и Lipogems, которые поставляли комплекты для обработки жировой ткани. Образцы тканей взрослых людей были закуплены с полным разрешением этики Комитета по этике исследований юго-восточной Шотландии (справка: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- . Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
