Hücre Fenotimi ve Sekretom Karakterizasyonu için İnsan Yağ Dokusu Mikro-parçalanma
Summary
Burada, kapalı bir sistem cihazı kullanarak insan yağ dokusu enzimsiz mikro-parçalanma sıyoruz. Bu yeni yöntem, in vivo transplantasyon, in vitro kültür ve daha fazla hücre izolasyonu ve karakterizasyonu için uygun yağ dokusunun milimetre altı kümelerinin elde edilmesine olanak sağlar.
Abstract
Son on yılda, yağ dokusu nakli yaygın doku repletion ve / veya rejenerasyon geliştirmek için plastik cerrahi ve ortopedi de kullanılmıştır. Buna göre, insan yağ dokusunun hasat ve işleme teknikleri, büyük miktarda dokuyu hızlı ve verimli bir şekilde elde etmek için gelişmiştir. Bunlar arasında, kapalı sistem teknolojisi, rafine yağ dokusunun kısa sürede ve aynı müdahalede (intra-operatif) hasat, işleme ve yeniden enjekte edilen yenilikçi ve kullanımı kolay bir sistemi temsil eder. Adipoz dokusu liposuction ile toplanır, yıkanır, emülsifiye edilir, durulanır ve mekanik olarak 0,3 ila 0,8 mm hücre kümelerine doğrlanır. Mekanik olarak parçalanmış yağ dokusunun otolog transplantasyonu farklı terapötik terapide dikkate değer bir etkinlik göstermiştir estetik tıp ve cerrahi, ortopedik ve genel cerrahi gibi endikasyonlar. Mikro-parçalanmış yağ dokusunun karakterizasyonu, adiposit kümeleri içinde bozulmamış küçük damarların varlığını ortaya; bu nedenle, perivasküler niş tedirgin bırakılır. Bu kümeler perivasküler hücrelerde zenginleştirilmiştir (yani, mezenkimal kök hücre (MSC) ataları) ve in vitro analizler enzimatik olarak elde edilen MSC’lere kıyasla, doku onarımı ve rejenerasyonunda rol oynayan büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin salınımını artırdı. Bu mikroparçalanmış yağ dokusunun üstün terapötik potansiyeli varsayımsal MSCs ve gelişmiş salgı aktivitesi daha yüksek bir sıklıkta açıklanır düşündürmektedir. Bu eklenen perisitlerin doğrudan daha yüksek büyüme faktörüne ve sitokin üretimine katkıda bulunup bulunmadığı bilinmemektedir. Klinik olarak onaylanmış bu prosedür, genişleme ve/veya enzimatik tedaviye gerek kalmadan, GMP kılavuzlarının gerekliliklerini atlayarak ve hücre bazlı tedavilerin maliyetlerini azaltarak, varsayımsal MSC’lerin nakline olanak sağlar.
Introduction
Adipoz doku, uzun rekonstrüktif ve kozmetik cerrahi bir dolgu olarak kullanılan, son zamanlarda daha popüler bir kez mezenkimal kök hücreler için bir kaynak olarak tanınan rejeneratif tıp haline gelmiştir (MSCs)1. Lipoaspirates tek hücreli süspansiyonlar içine enzimatik ayrıştırılmış hastada değiştirilmeden kullanılan bir adiposit içermeyen stromal vasküler fraksiyonu (SVF) verim veya daha yaygın olarak, MSCs içine birkaç hafta kültürlü2.
Ancak, enzim dissosiasyonu doku mikroortamlarını yırtar, in vitro kültür tarafından önemli ölçüde modifiye edilen varsayımsal rejeneratif hücrelerden komşu düzenleyici hücrelerden göz lerden uzaktır. Bu tür deneysel eserler ve sonuç fonksiyonel değişiklikler önlemek için, girişimleri mümkün olduğunca bozulmamış olarak doğal yapılandırma korurken terapötik kullanım için yağ dokusu işlemek için yapılmıştır3,4. Özellikle mekanik doku bozulması enzimatik dissosilasyonun yerini almaya başlamıştır. Bu amaçla, tam daldırma kapalı sistem mikro-parçaları lipoaspirates içine milimetre, kan- ve yağsız doku kümeleri (örneğin, Lipogems) elek filtrasyon ve çelik mermer indüklenen bozulma bir dizi aracılığıyla3. Mikro parçalı yağ dokusunun otolog transplantasyonu, bu kapalı sistem teknolojisini kullanarak, kozmetik, ortopedi, proktoloji ve jinekoloji4,5 , 6,7,8,9,10,11,12,13.
Kapalı sistem cihazı ve izojenik SVF ile elde edilen insan mikro-parçalanmış yağ dokusu (MAT) arasında yapılan karşılaştırmada, kültürde vasküler/stromal hücre dağılımı ve salgı aktivitesi açısından MAT’ın daha fazla perisit içerdiğini ortaya koymuştur. presumptive MSCs14, ve büyüme faktörleri ve sitokinler15daha yüksek miktarlarda salgılar .
Bu makalede, kapalı bir sistem cihazı kullanılarak insan deri altı yağ dokusunun enzimsiz mikro-parçalanması ve in vitro kültür, immünohistokimya ve FACS analizi için bu mikronize edilmiş yağ dokusunun daha fazla işlenmesi, mevcut hücre tiplerini ve salgılanan çözünür faktörleri belirlemek için (Şekil 1). Açıklanan yöntem, daha fazla uygulama ve çalışmalar için uygun olan, sağlam bir niş içinde canlı yağ dokusu hücre popülasyonları içeren yağ türetilmiş milimetre-altı organoidler güvenli bir şekilde üretir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazı, normal yağ dokusu mikroanatomi gösteren küçük kümeler halinde insan yağ dokusukapalı bir sistem cihazı kullanarak, fiziksel fraksiyonu açıklar.
Elle emişli insan deri altı yağ dokusu ve tuzlu çözelti, cihazın güçlü manuel sallayarak üzerine, alt milimetre içine yağ yırtmak büyük langırt tarzı metalik küreler içeren şeffaf bir plastik silindir içine yüklenir Parça. Ekli filtreler ve priz enkaz ortadan kaldırılması na izin, kan ve serbest lipidler v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Edinburgh Üniversitesi’nden Claire Cryer ve Fiona Rossi’ye akış sitometrisi konusunda uzman yardımları için teşekkür etmek istiyorlar. Ayrıca doku örnekleri sağlayarak katkıda bulunan Murrayfield hastanesi personeline de teşekkür ederiz.
Bu çalışma, İngiliz Kalp Vakfı ve Lipogems’in yağ doku işleme kitleri sağlayan bağışları ile desteklenmiştir. İnsan erişkin doku örnekleri Güney Doğu İskoçya Araştırma Etik Komitesi’nin tam etik izni ile temin edilmiştir (referans: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- . Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
