Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung
Summary
Hier präsentieren wir menschliche Fettgewebe enzymfreie Mikrofragmentierung mit einem geschlossenen Systemgerät. Diese neue Methode ermöglicht die Gewinnung von Submillimeter-Clustern von Fettgewebe, die für In-vivo-Transplantationen, In-vitro-Kulturen und weitere Zellisolation und -charakterisierung geeignet sind.
Abstract
In den letzten zehn Jahren wurden Fettgewebetransplantationen häufig in der plastischen Chirurgie und Orthopädie eingesetzt, um die Gewebeaufreicherung und/oder Regeneration zu verbessern. Dementsprechend haben sich Techniken zur Ernte und Verarbeitung von menschlichem Fettgewebe entwickelt, um schnell und effizient große Mengen an Gewebe zu erhalten. Unter diesen stellt die geschlossene Systemtechnologie ein innovatives und einfach zu bedienendes System zur Ernte, Verarbeitung und Reinjektion von raffiniertem Fettgewebe in kurzer Zeit und in der gleichen Intervention (intraoperativ) dar. Adiposegewebe wird durch Fettabsaugung, gewaschen, emulgiert, gespült und mechanisch in Zellcluster von 0,3 bis 0,8 mm gehackt. Indikationen wie ästhetische Medizin und Chirurgie, orthopädische und allgemeine Chirurgie. Die Charakterisierung von mikrofragmentiertem Fettgewebe ergab das Vorhandensein intakter kleiner Gefäße in den Adipozyten-Clustern; daher bleibt die perivaskuläre Nische ungestört. Diese Cluster sind in perivaskulären Zellen angereichert (d. h. mesenchymale Stammzell (MSC) Vorfahren) und In-vitro-Analysen zeigten eine erhöhte Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, die an der Gewebereparatur und -regeneration beteiligt sind, im Vergleich zu enzymatisch abgeleiteten MSCs. Dies deutet darauf hin, dass das überlegene therapeutische Potenzial des mikrofragmentierten Fettgewebes durch eine höhere Häufigkeit von mutmaßlichen MSCs und verbesserte sekretore Aktivität erklärt wird. Ob diese zusätzlichen Pericyte direkt zu einem höheren Wachstumsfaktor und zur Zytokinproduktion beitragen, ist nicht bekannt. Dieses klinisch zugelassene Verfahren ermöglicht die Transplantation mutmaßlicher MSCs ohne Erweiterung und/oder enzymatische Behandlung, wodurch die Anforderungen der GMP-Richtlinien umgangen werden und die Kosten für zellbasierte Therapien gesenkt werden.
Introduction
Adipose Gewebe, lange als Füllstoff in der rekonstruktiven und kosmetischen Chirurgie verwendet, ist in letzter Zeit beliebter in der regenerativen Medizin einmal als Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs)anerkannt1 . Lipoaspiraturen, die enzymatisch in einzellige Suspensionen dissoziiert sind, ergeben eine adipozytenfreie stromale Gefäßfraktion (SVF), die unverändert beim Patienten verwendet wird oder, häufiger, für mehrere Wochen in MSCs2kultiviert wird.
Die Enzymdissoziation bricht jedoch die Gewebemikroumgebungen und schützt benachbarte regulatorische Zellen von mutmaßlichen regenerativen Zellen ab, die durch die In-vitro-Kultur erheblich verändert werden. Um solche experimentellen Artefakte und daraus resultierenden funktionellen Veränderungen zu vermeiden, wurden Versuche unternommen, Fettgewebe für den therapeutischen Gebrauch zu verarbeiten und gleichzeitig seine native Konfiguration so intakt wie möglich zu halten3,4. Insbesondere die mechanische Gewebestörung hat begonnen, die enzymatische Dissoziation zu ersetzen. Zu diesem Zweck wird das vollständige Tauchsystem Mikrofragmente Lipoaspiraten in submillimeter-, blut- und ölfreie Gewebehaufen (z.B. Lipogems) über eine Sequenz von Siebfiltration und Stahlmarmor induzierte Störung3. Die autologe Transplantation von mikrofragmentiertem Fettgewebe mit dieser geschlossenen Systemtechnologie war in mehreren Indikationen erfolgreich, die Kosmetika, Orthopädie, Proktologie und Gynäkologie umfassen4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Der Vergleich zwischen menschlichem mikrofragmentiertem Fettgewebe (MAT), das mit dem geschlossenen Systemgerät gewonnen wurde, und isogener SVF ergab, dass MAT in Bezug auf die vaskuläre/stromale Zellverteilung und die sekretorische Aktivität in der Kultur mehr Pericyte enthält, die mutmaßliche MSCs14und sezerniert höhere Mengen an Wachstumsfaktoren und Zytokinen15.
Der vorliegende Artikel veranschaulicht die enzymfreie Mikrofragmentierung des menschlichen subkutanen Fettgewebes mit einem geschlossenen Systemgerät und die Weiterverarbeitung solcher mikronisierten Fettgewebe für In-vitro-Kultur, Immunhistochemie und FACS-Analyse, um die vorhandenen Zelltypen und die sezernierten löslichen Faktoren zu identifizieren (Abbildung 1). Die beschriebene Methode erzeugt sicher adipose abgeleitete Submillimeter-Organoide, die lebensfähige Fettgewebezellpopulationen in einer intakten Nische enthalten, die für weitere Anwendungen und Studien geeignet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt die physikalische Fraktionierung von menschlichem Fettgewebe in kleinen Clustern, die normale Fettgewebe-Mikroanatomie zeigen, mit einem geschlossenen Systemgerät.
Manuell angesaugte menschliches subkutanes Fettgewebe und eine Saline-Lösung werden in einen transparenten Kunststoffzylinder geladen, der große metallische Kugeln im Flipperstil enthält, die beim kräftigen manuellen Schütteln des Geräts das Fett in sub-Millimeter zerbrechen. Fragmente. Angeschlossene…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Claire Cryer und Fiona Rossi von der Universität Edinburgh für ihre fachkundige Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir möchten auch dem Personal des Murrayfield-Krankenhauses danken, das durch die Bereitstellung von Gewebeproben dazu beigetragen hat.
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der British Heart Foundation und Lipogems unterstützt, die Fettgewebe-Verarbeitungskits lieferten. Menschliche Gewebeproben für Erwachsene wurden mit vollständiger ethischer Genehmigung der South East Scotland Research Ethics Committee beschafft (Referenz: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
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