Humant fedtvæv mikro-fragmentering for celle Phenotyping og Sekretome karakterisering
Summary
Her præsenterer vi humant fedtvæv enzym-fri mikro-fragmentering ved hjælp af en lukket systemenhed. Denne nye metode tillader erhvervelse af sub-millimeter klynger af fedtvæv egnet til in vivo transplantation, in vitro-kultur, og yderligere celle isolation og karakterisering.
Abstract
I de seneste ti år, fedtvæv transplantationer har været meget anvendt i plastikkirurgi og ortopædi til at forbedre vævs genskabelse og/eller regenerering. Derfor har teknikker til høst og forarbejdning af humant fedtvæv udviklet sig for hurtigt og effektivt at opnå store mængder væv. Blandt disse, den lukkede system teknologi repræsenterer en innovativ og nem at bruge systemet til høst, proces, og re-injicere raffineret fedtvæv på kort tid og i samme intervention (intra-operativt). Fedtvæv opsamles ved fedtsugning, vasket, emulgeret, skyllet og hakket mekanisk i celle klynger på 0,3 til 0,8 mm. autolog transplantation af mekanisk fragmenteret fedtvæv har vist bemærkelsesværdig effekt i forskellige terapeutiske indikationer såsom æstetisk medicin og kirurgi, ortopædisk og generel kirurgi. Karakterisering af mikro-fragmenteret fedtvæv afslørede tilstedeværelsen af intakte små fartøjer i fedtcellerne klynger; Derfor, den perivaskulære niche er overladt unperturbed. Disse klynger er beriget i perivaskulære celler (dvs., mesenchymal stamcelle (MSC) forfædre) og in vitro-analyse viste en øget frigivelse af vækstfaktorer og cytokiner involveret i vævsreparation og regenerering, sammenlignet med enzymatisk afledte MSCs. Dette tyder på, at det overlegne terapeutiske potentiale af mikrofragmenteret fedtvæv forklares ved en højere hyppighed af formodede MSCs og øget sekretorisk aktivitet. Hvorvidt disse tilsat pericytes direkte bidrager til højere vækstfaktor og cytokin produktion er ikke kendt. Denne klinisk godkendte procedure muliggør transplantation af formodede MSCs uden behov for udvidelse og/eller enzymatisk behandling, hvorved kravene i GMP-retningslinjerne tilsidesættes, og omkostningerne til cellebaserede terapier reduceres.
Introduction
Fedtvæv, længe brugt som fyldstof i rekonstruktiv og kosmetisk kirurgi, er for nylig blevet mere populær i regenerativ medicin engang anerkendt som en kilde til mesenchymal stamceller (MSCs)1. Lipoaspirater dissocieres enzymatisk til enkelt celle suspensioner giver en adipocyt-fri stromale vaskulær fraktion (SVF), der anvendes uændret i patienten eller, mere almindeligt, dyrkes i flere uger i MSCs2.
Men, enzym dissociation rupturer vævs mikromiljøer, herunder tilstødende regulerende celler fra formodede regenerativ celler, der bliver betydeligt modificeret ved in vitro-kultur. For at undgå sådanne eksperimentelle artefakter og deraf følgende funktionelle ændringer, forsøg er blevet gjort for at behandle fedtvæv til terapeutisk brug samtidig bevare sin Native konfiguration så intakt som muligt3,4. Især er mekanisk vævs forstyrrelse begyndt at erstatte enzymatisk dissociation. Til dette formål, den fulde fordybelse lukket system mikro-fragmenter lipoaspirater i sub-millimeter, blod-og oliefri vævs klynger (f. eks, lipogems) via en sekvens af sigte filtrering og stål marmor induceret afbrydelse3. Autologt transplantation af mikro-fragmenteret fedtvæv, ved hjælp af denne lukkede system teknologi, har været en succes i flere indikationer, spænder kosmetik, ortopædi, proctology og Gynækologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Sammenligning mellem humant mikro-fragmenteret fedtvæv (MAT) opnået med det lukkede system anordning og isogene SVF viste, at med hensyn til vaskulær/stromale celle fordeling og sekretoriske aktivitet i kultur, MAT indeholder mere pericytes, som er formodede MSCs14, og udskiller større mængder af vækstfaktorer og cytokiner15.
Denne artikel illustrerer enzym-fri mikro-fragmentering af humant subkutant fedtvæv ved hjælp af en lukket system anordning, og den videre behandling af sådanne mikroniserede fedtvæv for in vitro-kultur, immunhistokemi og FACS analyse, for at identificere de tilstedeværende celletyper og de opløselige faktorer, som udskilles (figur 1). Den beskrevne metode genererer sikkert fedtvæv afledte sub-millimeter organoider indeholdende levedygtige fedtvæv cellepopulationer i en intakt niche, egnet til yderligere applikationer og undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver den fysiske fraktionering, ved hjælp af en lukket systemenhed, af humant fedtvæv i små klynger, der viser normal fedtvæv mikroanatomi.
Manuelt aspireret humant subkutant fedtvæv og saltopløsning er indlæst i en gennemsigtig plastik cylinder, der indeholder store Pinball-stil metalliske kugler, der efter kraftig manuel rystning af enheden, ruptur fedt i sub-millimeter Fragmenter. Vedlagte filtre og udløb tillader eliminering af snavs, blod og frie lipider og MÅTTE…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Claire Cryer og Fiona Rossi på universitetet i Edinburgh for deres eksperthjælp med flow cytometry. Vi vil også gerne takke personalet på Murrayfield Hospital, der bidrog ved at levere vævsprøver.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra British Heart Foundation og Lipogems, som leverede fedtvæv behandlings kits. Humane voksne vævsprøver blev udtaget med fuld etik tilladelse fra South East Scotland Research etik Committee (reference: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- . Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
