Micro-fragmentação do tecido adiposo humano para a caracterização do Phenotyping e do Secretome da pilha
Summary
Aqui, nós apresentamos o tecido adiposo humano microfragmentação enzima-livre usando um dispositivo fechado do sistema. Este novo método permite a obtenção de aglomerados de submilímetro de tecido adiposo adequado para transplante in vivo, cultura in vitro e maior isolamento e caracterização celular.
Abstract
Na última década, os transplantes de tecido adiposo têm sido amplamente utilizados na cirurgia plástica e ortopedia para melhorar a reposição tecidual e/ou regeneração. Assim, as técnicas de colheita e processamento do tecido adiposo humano evoluíram de forma rápida e eficiente para obter grandes quantidades de tecido. Entre estes, a tecnologia de sistema fechado representa um sistema inovativo e easy-to-use para colher, processar, e re-injetar o tecido gordo refinado em um curto período de tempo e na mesma intervenção (intra-operatively). O tecido adiposo é coletado por lipoaspiração, lavado, emulsionado, lavado e picado mecanicamente em aglomerados de células de 0,3 a 0,8 mm. a transplantação autóloga do tecido adiposo mecanicamente fragmentou demonstrou a eficácia notável em diferentes terapêutica indicações como medicina estética e cirurgia, Ortopedia e cirurgia geral. A caracterização do tecido adiposo microfragmentado revelou a presença de pequenos vasos intactos dentro dos aglomerados de adipócitos; daqui, o Niche perivascular é deixado unperturbed. Estes aglomerados são enriquecidos em células perivasculares (i.e., ancestrais de células-tronco mesenquimais (MSC)) e a análise in vitro mostrou uma maior liberação de fatores de crescimento e citocinas envolvidas na reparação e regeneração tecidual, em comparação com os MSCs enzimaticamente derivados. Isto sugere que o potencial terapêutico superior do tecido adiposo microfragmentado seja explicado por uma freqüência mais elevada de MSCS presuntivos e de atividade secretora realçada. Se estes pericitos adicionados contribuem diretamente ao fator de crescimento mais elevado e à produção do citocinas não é sabido. Este procedimento clinicamente aprovado permite a transplantação de MSCs presuntivos sem a necessidade para a expansão e/ou o tratamento enzimático, assim ignorando as exigências de directrizes do PBF, e reduzindo os custos para terapias Cell-Based.
Introduction
O tecido adiposo, usado por muito tempo como um enchimento na cirurgia reconstrutiva e cosmética, tornou-se recentemente mais popular na medicina regenerativa reconhecida uma vez como uma fonte para pilhas de haste mesenquimais (MSCS)1. Os lipoaspirates dissociados enzimaticamente em suspensões da único-pilha rendem uma fração vascular stromal adipocyte-livre (SVF) que seja usada inalterada no paciente ou, mais geralmente, é cultivada por diversas semanas em MSCs2.
No entanto, a dissociação enzimática rompe os microsambientes teciduais, isolando células reguladoras vizinhas de células regenerativas presuntivas que se tornam consideravelmente modificadas pela cultura in vitro. Para evitar tais artefatos experimentais e conseqüentes alterações funcionais, foram feitas tentativas para processar o tecido adiposo para usoterapêutico, mantendosua configuração nativa tão intacta quanto possível3,4. Notavelmente, a ruptura do tecido mecânico começou a substituir a dissociação enzimática. Para este fim, os microfragmentos fechados do sistema da imersão cheia lipoaspirates em aglomerados do tecido do secundário-milímetro, do sangue-e do óleo-livre (por exemplo, Lipogems) através de uma seqüência da filtração da peneira e do rompimento induzido mármore de aço3. A transplantação autóloga do tecido adiposo micro-fragmentado, usando esta tecnologia Closed do sistema, foi bem sucedida em indicações múltiplas, abrangendo cosméticos, orthopedics, Proctologia e Ginecologia4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
A comparação entre o tecido adiposo microfragmentado humano (MAT) obtido com o dispositivo fechado do sistema e o SVF isogênicos revelou que com respeito à distribuição vascular/stromal da pilha e à atividade secretora na cultura, a esteira contem mais pericytes, que são presuntivos MSCS14, e secreta maiores quantidades de fatores de crescimento e citocinas15.
O artigo atual ilustra a microfragmentação enzima-livre do tecido adiposo subcutaneous humano usando um dispositivo fechado do sistema, e o processamento mais adicional de tal tecido adiposo micronizada para a cultura in vitro, immunohistochemistry e a análise de FACS, a fim de identificar os tipos de células presentes e os fatores solúveis secretados (Figura 1). O método descrito com segurança gera os organóides derivados do submilímetro do adiposo que contêm populações viáveis da pilha do tecido adiposo em um nicho intacto, apropriado para umas aplicações e uns estudos mais adicionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este papel descreve o fractionation físico, usando um dispositivo fechado do sistema, do tecido adiposo humano em conjuntos pequenos que indicam a microanatomia normal do tecido adiposo.
O tecido adiposo subcutaneous humano manualmente aspirado e a solução salina são carregados em um cilindro plástico transparente que contem grandes esferas metálicas do pinball-estilo que, em cima da agitação manual vigorosa do dispositivo, rompam a gordura no submilímetro Fragmentos. Filtros anexados…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer a Claire Cryer e Fiona Rossi na Universidade de Edimburgo por sua assistência especializada com citometria de fluxo. Também gostaríamos de agradecer ao pessoal do hospital Murrayfield que contribuiu com o fornecimento de espécimes de tecidos.
Este trabalho foi apoiado por subvenções da British Heart Foundation e Lipogems, que forneceu kits de processamento de tecidos adiposos. Amostras de tecido adulto humano foram adquiridas com total permissão de ética do Comitê de ética em pesquisa do sudeste da Escócia (referência: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
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