Microfragmentación de tejido adiposo humano para fenotipado celular y caracterización de secretos
Summary
Aquí, presentamos microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado. Este nuevo método permite la obtención de racimos submilimétricos de tejido adiposo adecuado para el trasplante in vivo, el cultivo in vitro y el aislamiento y caracterización celular adicional.
Abstract
En la última década, los trasplantes de tejido adiposo se han utilizado ampliamente en cirugía plástica y ortopedia para mejorar el agotamiento y/o regeneración de tejidos. En consecuencia, las técnicas para cosechar y procesar el tejido adiposo humano han evolucionado con el fin de obtener rápida y eficientemente grandes cantidades de tejido. Entre ellos, la tecnología de sistema cerrado representa un sistema innovador y fácil de usar para cosechar, procesar y reinyectar tejido graso refinado en poco tiempo y en la misma intervención (intraoperatoriamente). El tejido adiposo se recoge mediante liposucción, lavado, emulsionado, enjuagado y picado mecánicamente en grupos celulares de 0,3 a 0,8 mm. El trasplante autólogo de tejido adiposo fragmentado mecánicamente ha demostrado una eficacia notable en diferentes grupos terapéuticos indicaciones como medicina estética y cirugía, cirugía ortopédica y general. La caracterización del tejido adiposo microfragmentado reveló la presencia de pequeños vasos intactos dentro de los cúmulos de adipocitos; por lo tanto, el nicho perivascular se deja imperturbado. Estos cúmulos se enriquecen en células perivasculares (es decir, ancestros de células madre mesenquimales (MSC)) y el análisis in vitro mostró una mayor liberación de factores de crecimiento y citoquinas implicadas en la reparación y regeneración de tejidos, en comparación con los MSC derivados enzimáticamente. Esto sugiere que el potencial terapéutico superior del tejido adiposo microfragmentado se explica por una mayor frecuencia de LOS CONE presuntivos y una mayor actividad secretora. No se sabe si estos pericitas añadidos contribuyen directamente a un mayor factor de crecimiento y a la producción de citoquinas. Este procedimiento clínicamente aprobado permite el trasplante de MSC presuntivas sin necesidad de expansión y/o tratamiento enzimático, evitando así los requisitos de las directrices GMP, y reduciendo los costos de las terapias basadas en células.
Introduction
El tejido adiposo, utilizado durante mucho tiempo como relleno en cirugía reconstructiva y estética, se ha vuelto recientemente más popular en la medicina regenerativa una vez reconocida como una fuente de células madre mesenquimales (MSC)1. Los lipoaspirados disociados disociados enzimáticamente en suspensiones de una sola célula producen una fracción vascular estromal libre de adipocitos (SVF) que se utiliza inalterada en el paciente o, más comúnmente, se cultiva durante varias semanas en los MSC2.
Sin embargo, la disociación enzimática rompe los microambientes tisulares, asegurando las células reguladoras vecinas de células regenerativas presuntivas que se modifican considerablemente por el cultivo in vitro. Para evitar tales artefactos experimentales y las consiguientes alteraciones funcionales, se han intentado procesar el tejido adiposo para uso terapéutico manteniendo intacta su configuración nativa como posible3,4. En particular, la interrupción mecánica del tejido ha comenzado a reemplazar la disociación enzimática. Con este fin, los microfragmentos de sistema cerrado de inmersión completa lipoaspirados en racimos de tejido submilimétrico, libre de sangre y aceite (por ejemplo, Lipogems) a través de una secuencia de filtración de tamiz y alteración inducida por mármol de acero3. El trasplante autólogo de tejido adiposo microfragmentado, utilizando esta tecnología de sistema cerrado, ha tenido éxito en múltiples indicaciones, abarcando cosméticos, ortopedia, proctología y ginecología4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
La comparación entre el tejido adiposo microfragmentado humano (MAT) obtenido con el dispositivo del sistema cerrado y el SVF isogénico reveló que con respecto a la distribución de células vasculares/estromales y la actividad secretora en el cultivo, MAT contiene más pericitas, que son presuntos MSCs14, y secreta mayores cantidades de factores de crecimiento y citoquinas15.
El presente artículo ilustra la microfragmentación libre de enzimas del tejido adiposo subcutáneo humano utilizando un dispositivo de sistema cerrado, y el procesamiento posterior de dicho tejido adiposo micronizado para cultivo in vitro, inmunohistoquímica y análisis FACS, para identificar los tipos de células presentes y los factores solubles secretados(Figura 1). El método descrito genera de forma segura organoides submilimétricos derivados de adiposoques que contienen poblaciones viables de células de tejido adiposo en un nicho intacto, adecuado para aplicaciones y estudios adicionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe el fraccionamiento físico, utilizando un dispositivo de sistema cerrado, de tejido adiposo humano en pequeños grupos que muestran la microanatomía normal del tejido adiposo.
El tejido adiposo subcutáneo humano aspirado manualmente y la solución salina se cargan en un cilindro de plástico transparente que contiene grandes esferas metálicas al estilo pinball que, tras el vigoroso temblor manual del dispositivo, rompen la grasa en submilimetro Fragmentos. Los filtro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Claire Cryer y Fiona Rossi de la Universidad de Edimburgo por su asistencia experta en citometría de flujo. También queremos dar las gracias al personal del hospital Murrayfield que contribuyó proporcionando especímenes de tejido.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la British Heart Foundation y Lipogems, que suministraban kits de procesamiento de tejido adiposo. Las muestras de tejido súbditos humanos se adquirieron con el pleno permiso de ética del Comité de ética de investigación del sureste de Escocia (referencia: 16/SS/0103).
Materials
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405nm (violet)/375nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13Gx185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human – PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17GX185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385nm; 488: Blue, excitation 475nm; 555: Green, excitation 555nm; 647:Red, excitation 630nm |
Referências
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