Generatie van ventriculaire-achtige HiPSC-afgeleide cardio myocyten en hoogwaardige celpreparaten voor de karakterisering van calcium behandeling
Summary
Hier beschrijven en valideren we een methode voor het consequent genereren van robuuste menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardio myocytes en karakteriseren hun functie. Deze technieken kunnen helpen bij het ontwikkelen van mechanistisch inzicht in signalering trajecten, bieden een platform voor grootschalige drug screening, en betrouwbaar model cardiale ziekten.
Abstract
Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMs) bieden een waardevolle menselijke bron voor het bestuderen van de basiswetenschap van calcium (CA2 +) handling en signalering trajecten evenals high-throughput drug screening en toxiciteit testen. Hierin geven we een gedetailleerde beschrijving van de methoden die worden gebruikt voor het genereren van hoogwaardig iPSC-CMs dat moleculaire en functionele kenmerken consistent kan reproduceren over verschillende cellijnen. Bovendien wordt een methode beschreven om hun functionele karakterisering te beoordelen door de evaluatie van CA2 + handling-eigenschappen. Lage zuurstof (O2) voorwaarden, lactaat selectie, en langdurige tijd in de cultuur produceren hoge zuiverheid en hoge kwaliteit ventriculaire-achtige cardio myocyten. Vergelijkbaar met geïsoleerde volwassen rat cardiomyocyten (ARCMs), 3-maand-oude iPSC-CMs vertonen hogere CA2 + amplitude, sneller tempo van CA2 + reuptake (Decay-tau), en een positieve lusitropic respons op β-adrenerge stimulatie in vergelijking met dag 30 IPSC-CMS. De strategie is technisch eenvoudig, kostenbesparend en reproduceerbaar. Het biedt een robuust platform voor het modelleren van hartziekten en voor de grootschalige geneesmiddelen screening gericht op ca2 + handling eiwitten.
Introduction
Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (IPSC-CMs) zijn een aantrekkelijk mens-gebaseerd platform om een grote verscheidenheid aan hartziekten in vitro1,2,3,4,5,6,7,8te modelleren. Bovendien kan IPSC-CMs worden gebruikt voor de voorspelling van patiënt reacties op nieuwe of bestaande geneesmiddelen, om hit verbindingen te scherm en nieuwe gepersonaliseerde drugs te ontwikkelen9,10. Echter, ondanks aanzienlijke vooruitgang, verschillende beperkingen en uitdagingen moeten worden overwogen bij het gebruik van iPSC-CMs11. Dientengevolge, methoden om cardiale differentiatie protocollen te verbeteren, om de efficiëntie en rijping van IPSC-CMs te verbeteren en om specifieke hartspier subtypen (ventriculaire, atriale en nodal) te genereren, zijn intens bestudeerd en hebben al geleid tot talrijke cultuur strategieën om deze hindernissen te overwinnen12,13,14,15.
Niettegenstaande de robuustheid van deze protocollen, is een belangrijke zorg voor het gebruik van iPSC-CMs de reproduceerbaarheid van lange en complexe procedures om hoogwaardige cardio myocytes te verkrijgen die dezelfde prestaties en reproduceerbare resultaten kunnen garanderen. Reproduceerbaarheid is niet alleen essentieel bij het vergelijken van cellijnen met verschillende genetische achtergronden, maar ook bij het herhalen van cellulaire en moleculaire vergelijkingen van dezelfde cellijn. Celvariabiliteit, zoals well-to-well verschillen in iPSCs-dichtheid, kan cardiale differentiatie beïnvloeden, waardoor een lage opbrengst en cardiomyocyten van slechte kwaliteit worden gegenereerd. Deze cellen kunnen nog steeds worden gebruikt om experimenten uit te voeren waarvoor geen zuivere populatie CMs nodig is (bijvoorbeeld bij het uitvoeren van CA2 + tijdelijke metingen). Inderdaad, bij het uitvoeren van elektrofysiologische analyse zal het niet-CMs niet kloppen, noch spontaan noch onder elektrische stimulatie, dus het zal gemakkelijk zijn om ze uit de analyse uit te sluiten. Vanwege de slechte kwaliteit kan iPSC-CMs echter veranderde elektrofysiologische kenmerken vertonen (bijv. onregelmatige CA2 + voorbijgaande, lage CA2 + amplitude) die niet te wijten zijn aan hun genetische make-up. Daarom, vooral bij het gebruik van iPSC-CMs om cardiale ziekte te modelleren, is het belangrijk om de resultaten van een slechte kwaliteit CM met de ziekte fenotype niet te verwarren. Voorafgaand aan elektrofysiologische studies zijn zorgvuldige screening-en uitsluitings processen vereist.
Deze methode omvat geoptimaliseerde protocollen voor het genereren van hoge zuiverheid en hoge kwaliteit cardiomyocyten en om hun functie te beoordelen door het uitvoeren van CA2 + voorbijgaande metingen met behulp van een calcium en contractiliteit acquisitie en analysesysteem. Deze techniek is een eenvoudige, maar krachtige manier om onderscheid te maken tussen hoge efficiëntie en lage efficiëntie iPSC-CM-preparaten en een fysiologisch relevante karakterisering van humaan iPSC-CMs te bieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen voor het gebruik van Human IPSC-CMs als experimentele modellen zijn: 1) het genereren van hoogwaardige hartspier (CMs) die de consistente prestaties en reproduceerbare resultaten kunnen garanderen; 2) de cellen gedurende ten minste 90 dagen in cultuur te laten rijpen om hun fenotype adequaat te kunnen beoordelen; 3) het uitvoeren van elektrofysiologische studies, bijvoorbeeld calcium (CA2 +) voorbijgaande metingen, om een fysiologisch relevante functionele karakterisering van humaan IPSC-CMs t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2-geleerden Award voor klinische en translationele Research loopbaanontwikkeling KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 en AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
Referências
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
- Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
- Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
- Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
- Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
- Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
- Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
- Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).
