Generierung von ventrikulären HiPSC-abgeleiteten Cardiomyozyten und hochwertigen Zellpräparaten für die Calciumhandling-Charakterisierung
Summary
Hier beschreiben und validieren wir eine Methode, um konsequent robuste humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten zu erzeugen und ihre Funktion zu charakterisieren. Diese Techniken können bei der Entwicklung mechanistischer Einblicke in Signalwege helfen, eine Plattform für groß angelegte Arzneimittelscreenings bieten und Herzkrankheiten zuverlässig modellieren.
Abstract
Humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) stellen eine wertvolle menschliche Quelle für die Untersuchung der grundlegenden Wissenschaft der Kalzium – Ca2+Handhabungs- und Signalwege sowie Hochdurchsatz-Medikamentenscreening und Toxizitätstests. Hierin bieten wir eine detaillierte Beschreibung der Methoden zur Erzeugung hochwertiger iPSC-CMs, die molekulare und funktionelle Eigenschaften über verschiedene Zelllinien hinweg konsistent reproduzieren können. Darüber hinaus wird eine Methode beschrieben, um ihre funktionelle Charakterisierung durch die Bewertung der Ca2+-Handlingeigenschaften zuverlässig zu bewerten. Niedrige Sauerstoffwerte (O2), Laktatauswahl und längere Kulturzeit erzeugen hochreine und hochwertige ventrikuläre Kardiomyozyten. Ähnlich wie isolierte adulte Rattenkardiomyozyten (ARCMs) weisen 3 Monate alte iPSC-CMs eine höhere Ca 2+-Amplitude, eine schnellere Aufnahmerate von Ca2+ (Decay-Tau) und eine positive lusidrope Reaktion auf die adrenerge Stimulation im Vergleich zu Tag 30 iPSC-CMs auf. Die Strategie ist technisch einfach, kostengünstig und reproduzierbar. Es bietet eine robuste Plattform, um Herzerkrankungen zu modellieren und für das groß angelegte Arzneimittelscreening, um Ca2+ umgangen von Proteinen zu zielen.
Introduction
Humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) sind eine attraktive menschliche Plattform, um eine Vielzahl von Herzerkrankungen in vitro1,2,3,4,5,6,7,8zu modellieren. Darüber hinaus können iPSC-CMs für die Vorhersage von Patientenreaktionen auf neuartige oder bestehende Medikamente verwendet werden, um Trefferverbindungen zu überprüfen und neue personalisierte Medikamente zu entwickeln9,10. Trotz erheblicher Fortschritte müssen jedoch bei der Verwendung von iPSC-CMs11mehrere Einschränkungen und Herausforderungen berücksichtigt werden. Folglich wurden Methoden zur Verbesserung der Kardialdifferenzierungsprotokolle, zur Verbesserung der Effizienz und Reifung von iPSC-CMs und zur Erzeugung spezifischer Kardiomyozytensubtypen (ventrikuläre, vorgerichtliche und knotenförmige) intensiv untersucht und bereits zu zahlreichen Kulturstrategien geführt, um diese Hürden zu überwinden12,13,14,15.
Ungeachtet der Robustheit dieser Protokolle ist die Reproduzierbarkeit langer und komplexer Verfahren zur Erzielung hochwertiger Kardiomyozyten, die die gleiche Leistung und reproduzierbare Ergebnisse gewährleisten können, ein großes Anliegen bei der Verwendung von iPSC-CMs. Reproduzierbarkeit ist nicht nur beim Vergleich von Zelllinien mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen von entscheidender Bedeutung, sondern auch bei der Wiederholung zellulärer und molekularer Vergleiche derselben Zelllinie. Zellvariabilität, wie z. B. gut-zu-gut Unterschiede in der iPSCs-Dichte, kann die Herzdifferenzierung beeinflussen und eine geringe Ausbeute und schlechte Qualität von Kardiomyozyten erzeugen. Diese Zellen könnten weiterhin für Experimente verwendet werden, die keine reine Population von CMs erfordern (z. B. bei der Durchführung von Ca2+ transienten Messungen). In der Tat, bei der Durchführung elektrophysiologischer Analysen, werden die Nicht-CMs nicht schlagen, weder spontan noch unter elektrischer Stimulation, so dass es leicht sein wird, sie von der Analyse auszuschließen. Aufgrund der schlechten Qualität können iPSC-CMs jedoch veränderte elektrophysiologische Eigenschaften aufweisen (z. B. unregelmäßige Ca2+ transiente, niedrige Ca2+ Amplitude), die nicht auf ihre genetische Zusammensetzung zurückzuführen sind. Daher ist es wichtig, insbesondere bei der Verwendung von iPSC-CMs zur Modellierung von Herzerkrankungen die Ergebnisse eines minderwertigen CM nicht mit dem Psapnotyp zu verwechseln. Vor der Fortagung elektrophysiologischer Studien sind sorgfältige Screening- und Ausschlussprozesse erforderlich.
Diese Methode umfasst optimierte Protokolle zur Erzeugung von hochreinen und qualitativ hochwertigen Kardiomyozyten und zur Bewertung ihrer Funktion durch transiente Ca2+-Messungen mit einem Calcium- und Kontraktilitätserfassungs- und -analysesystem. Diese Technik ist eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, zwischen hocheffizienten und niedereffizienten iPSC-CM-Präparaten zu unterscheiden und eine physiologisch relevantere Charakterisierung menschlicher iPSC-CMs zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte für die Verwendung menschlicher iPSC-CMs als experimentelle Modelle sind: 1) Erzeugung hochwertiger Kardiomyozyten (CMs), die die konsistente Leistung und reproduzierbare Ergebnisse gewährleisten können; 2) die Zellen in kulturreif für mindestens 90 Tage reifen lassen, um ihren Phänotyp angemessen zu bewerten; 3) Durchführung elektrophysiologischer Untersuchungen, z. B. transiente Kalziummessungen (Ca2+),um eine physiologisch relevante funktionelle Charakterisierung menschlicher iPSC-C…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch den AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.) unterstützt; Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 und AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
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