הדור של היפנוציטים באיכות גבוהה והתרופות לאפיון הטיפול בסידן
Summary
כאן אנו מתארים ולאמת שיטה כדי ליצור בעקביות באופן עקבי הנגרמת האנושי המושרה תא גזע מושרה ולאפיין את תפקידם. טכניקות אלה עשויות לסייע בפיתוח תובנה מכניסטית למסלולי איתות, לספק פלטפורמה לסינון תרופות בקנה מידה גדול ומחלות לב באופן אמין.
Abstract
תאי גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הקרדיוציטים (iPSC-CMs) לספק מקור אנושי יקר ללמוד את המדע הבסיסי של סידן (Ca2 +) טיפול מסלולים איתות, כמו גם הקרנות התפוקה גבוהה הקרנת תרופות רעילות. להלן, אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיות המשמשות להפקת iPSC-CMs באיכות גבוהה שיכול לשחזר בעקביות מאפיינים מולקולריים ופונקציונליים על פני קווי תאים שונים. בנוסף, מתוארת שיטה להעריך באופן אמין את האפיון הפונקציונלי שלהם באמצעות הערכה של מאפייני Ca2 + טיפול. חמצן נמוך (O2) התנאים, בחירת לקטט, וזמן ממושך בתרבות לייצר טוהר גבוהה ואיכות גבוהה, המוח כמו הקרדיוציטים. בדומה מבודד עכברוש מבוגר חולדה (ARCMs), 3-חודש-התערוכה iPSC-CMs גבוה יותר Ca2 + משרעת, שיעור מהיר יותר של ca2 + קליטה (ריקבון-טאו), ו תגובה lusitropic חיובית β-אדראררגיות גירוי לעומת יום 30 ipsc-CMs. האסטרטגיה היא טכנית פשוטה, חסכונית, והיא מתוכמת. הוא מספק פלטפורמה חזקה למודל לב מחלות ועבור הקרנת סמים בקנה מידה גדול כדי למקד Ca2 + טיפול בחלבונים.
Introduction
תא גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הגוף הנגזר (ipsc-CMs) הם פלטפורמה מבוססת אדם אטרקטיבי למודל מגוון גדול של מחלות לב מבחנה1,2,3,4,5,6,7,8. יתר על כן, ipsc-CMs יכול לשמש לחיזוי של תגובות המטופל לתרופות הרומן או הקיים, כדי למסך תרכובות פגע, ולפתח תרופות אישיות חדשה בהתאמה אישית9,10. עם זאת, למרות ההתקדמות המשמעותית, יש לשקול מספר מגבלות ואתגרים בעת שימוש ב-iPSC-CMs11. כתוצאה מכך, שיטות לשיפור פרוטוקולי בידול הלב, כדי לשפר את היעילות ipsc-CMs והתבגרות, וכלה לייצר מיני קרדיולוגית מסוימים (חדרית, פרפור, ו nodal) כבר למדו והובילו לאסטרטגיות רבות בתרבות כדי להתגבר על מכשולים אלה12,13,14,15.
על אף החוסן של פרוטוקולים אלה, הדאגה העיקרית לשימוש iPSC-CMs היא מהווה את האפשרות של הליכים ארוכים ומורכבים כדי להשיג קרדיוומיציטים באיכות גבוהה שיכול להבטיח ביצועים זהה ותוצאות לאורך זמן. הנוזפות היא קריטית לא רק בעת השוואת קווי התא עם רקעים גנטיים שונים, אלא גם כאשר חוזר השוואות סלולר ומולקולרי של אותו קו התא. שינויים בתאים, כגון הבדלים היטב בצפיפות iPSCs, עשויים להשפיע על בידול הלב, הפקת תשואה נמוכה ומנוציטים באיכות ירודה. תאים אלה עדיין יכול לשמש כדי לבצע ניסויים שאינם דורשים אוכלוסייה טהורה של CMs (למשל, בעת ביצוע Ca2 + ארעי מדידות). ואכן, בעת ביצוע ניתוח אלקטרולוגי, אי-CMs לא יכה, לא באופן ספונטני ולא מתחת לגירוי חשמלי, כך יהיה קל להוציא אותם מהניתוח. עם זאת, בגלל האיכות הירודה, iPSC-CMs יכול להראות מאפיינים אלקטרופיסיולוגיים שונה (למשל, Ca לא סדיר2 + ארעי, נמוך ca2 + משרעת) אשר אינם בשל האיפור הגנטי שלהם. לכן, במיוחד כאשר באמצעות iPSC-CMs למודל לב מחלות, חשוב לא לבלבל את התוצאות מ-CM באיכות נמוכה עם פנוטיפים למחלה. תהליכי הקרנה והדרה מזהירים נדרשים לפני שממשיכים ללמוד אלקטרופיסיולוגיים.
שיטה זו כוללת פרוטוקולים ממוטבים להפקת שימוש בטוהר גבוה ובאיכות גבוהה ולהערכת תפקידם על-ידי ביצוע מדידות של Ca2 + ארעי באמצעות מערכת הפקת סידן וניתוח. טכניקה זו היא פשוטה, אך רבת עוצמה, דרך להבדיל בין יעילות גבוהה לבין יעילות נמוכה ההכנות iPSC-CM ולספק אפיון מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי של iPSC-CMs אנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים לשימוש ב-iPSC-CMs האנושי כמודלים ניסיוניים הם: 1) היוצרים הקרדיוציטים באיכות גבוהה (CMs) שיכולים להבטיח את הביצועים העקביים ואת התוצאות הנוזניות; 2) המאפשר לתאים להבשיל בתרבות לפחות 90 ימים כדי להעריך כראוי את פנוטיפ שלהם; 3) ביצוע מחקרים אלקטרולוגיים, למשל סידן (Ca2 +) מדידות ארעי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המענק AHA מדען פיתוח מענק 17SDG33700093 (F.S.); פרס מKL2 של הר סיני לחקר המחקר הקליני והטרנסג KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ו AHA 18TPA34170460 (סי סי).
Materials
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
Referências
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
- Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
- Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
- Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
- Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
- Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
- Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
- Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).
