वेंट्रिकुलर की पीढ़ी-जैसे HiPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और कैल्शियम हैंडलिंग लक्षण वर्णन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले सेल की तैयारी
Summary
यहां हम लगातार मजबूत मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने और उनके कार्य की विशेषता के लिए एक विधि का वर्णन और मान्य करते हैं। इन तकनीकों के मार्ग संकेत में यंत्रवादी अंतर्दृष्टि विकसित करने में मदद कर सकते हैं, बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान करते हैं, और मज़बूती से मॉडल हृदय रोगों ।
Abstract
मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (iPSC-सीएम) कैल्शियम के बुनियादी विज्ञान (Ca2 + +)हैंडलिंग और संकेत रास्तों के साथ ही उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परख का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मानव स्रोत प्रदान करते हैं । इसके साथ, हम उच्च गुणवत्ता वाले आईपीएससी-सीएम उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियों का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं जो विभिन्न सेल लाइनों में आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं को लगातार पुन: पेश कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, सीए2 + हैंडलिंग गुणों के मूल्यांकन के माध्यम से उनके कार्यात्मक लक्षण वर्णन का मज़बूती से आकलन करने के लिए एक विधि वर्णित है। कम ऑक्सीजन (ओ2)स्थितियां, लैक्टेट चयन, और संस्कृति में लंबे समय तक उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले वेंट्रिकुलर जैसे कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन करते हैं। अलग वयस्क चूहा कार्डियोमायोसाइट्स (एआरसीएमएस) के समान, 3 महीने पुराने आईपीएससी-सीएम उच्च सीए2 + आयाम, सीए2 + रीटेक (क्षय-ताऊ) की तेज दर और दिन 30 आईपीएससी-सीएम की तुलना में एड्रेनेर्जिक उत्तेजना के लिए एक सकारात्मक लुसिट्रोपिक प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं। रणनीति तकनीकी रूप से सरल, लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य है। यह हृदय रोग मॉडल के लिए और बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग के लिए सीए2 + हैंडलिंग प्रोटीन को लक्षित करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है ।
Introduction
मानव प्रेरित प्लुरिपोटेम्पेट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) एक आकर्षक मानव आधारित मंच हैजो विट्रो1,2,3,4,5,6,7,8में हृदय रोगों की एक बड़ी विविधता को मॉडल करता है । इसके अलावा, आईपीएससी-सीएम का उपयोग उपन्यास या मौजूदा दवाओं के लिए रोगी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए, हिट यौगिकों को स्क्रीन करने और नई व्यक्तिगत दवाओंको विकसितकरने के लिए किया जा सकता है9,10। हालांकि, महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, आईपीएससी-सीएम11का उपयोग करते समय कई सीमाओं और चुनौतियों पर विचार करने की आवश्यकता है। नतीजतन, कार्डियक भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार करने, आईपीएससी-सीएम दक्षता और परिपक्वता को बढ़ाने के लिए, और विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट उपप्रकार (वेंट्रिकुलर, एट्रायल और नोडल) उत्पन्न करने के तरीकों का तीव्रता से अध्ययन किया गया है और पहले से ही इन बाधाओं को दूर करने के लिए कई संस्कृति रणनीतियों का नेतृत्व किया गयाहै 12,13,14,15।
इन प्रोटोकॉलकी मजबूती के बावजूद, आईपीएससी-सीएम के उपयोग के लिए एक बड़ी चिंता उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए लंबी और जटिल प्रक्रियाओं की प्रजनन क्षमता है जो एक ही प्रदर्शन और प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित कर सकती है। विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सेल लाइनों की तुलना करते समय न केवल प्रजनन क्षमता महत्वपूर्ण है, बल्कि एक ही कोशिका रेखा की सेलुलर और आणविक तुलना को दोहराते समय भी महत्वपूर्ण है। सेल परिवर्तनशीलता, जैसे कि आईपीएससी घनत्व में अच्छी तरह से अंतर, कार्डियक भेदभाव को प्रभावित कर सकता है, जिससे कम उपज और खराब गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स पैदा हो सकते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग अभी भी ऐसे प्रयोग करने के लिए किया जा सकता है जिनमें सीएम की शुद्ध आबादी की आवश्यकता नहीं होती है (उदाहरण के लिए, सीए2 + क्षणिक माप प्रदर्शन करते समय)। दरअसल, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण करते समय, गैर-सीएम न तो अनायास और न ही विद्युत उत्तेजना के तहत नहीं हराएंगे, इसलिए उन्हें विश्लेषण से बाहर करना आसान होगा। हालांकि, खराब गुणवत्ता के कारण, आईपीएससी-सीएम बदल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं (जैसे, अनियमित सीए2 + क्षणिक, कम सीए2 + आयाम) दिखा सकते हैं जो उनके आनुवंशिक मेकअप के कारण नहीं हैं। इसलिए, विशेष रूप से जब आईपीएससी-सीएम का उपयोग हृदय रोग मॉडल के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि रोग फेनोटाइप के साथ एक खराब गुणवत्ता वाले सीएम से परिणाम भ्रमित न करें। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों पर आगे बढ़ने से पहले सावधानीपूर्वक स्क्रीनिंग और बहिष्कार प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है।
इस विधि में उच्च शुद्धता और उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने और कैल्शियम और संकुचन अधिग्रहण और विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सीए2 + क्षणिक माप प्रदर्शन करके उनके कार्य का आकलन करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल शामिल हैं। यह तकनीक उच्च दक्षता और कम दक्षता वाले आईपीएससी-सीएम की तैयारियों के बीच अंतर करने और मानव आईपीएससी-सीएम का अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक लक्षण वर्णन प्रदान करने का एक सरल, अभी तक शक्तिशाली तरीका है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में मानव आईपीएससी-सीएम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) पैदा करना जो लगातार प्रदर्शन और प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित कर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को अहा वैज्ञानिक विकास अनुदान 17SDG33700093 (F.S.S.) द्वारा समर्थित किया गया था; माउंट सिनाई KL2 विद्वानों पुरस्कार नैदानिक और ट्रांसलेशनल रिसर्च कैरियर विकास KL2TR001435 (F.S.) के लिए; एनआईएच आर00 एचएल116645 व अहा 18TPA34170460 (सीके) ।
Materials
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
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