Generering av ventrikulär-liknande HiPSC-härledda Kardiomyocyter och högkvalitativa cell preparat för kalcium hantering karakterisering
Summary
Här beskriver och validerar vi en metod för att konsekvent generera robusta humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter och karakterisera deras funktion. Dessa tekniker kan bidra till att utveckla mekanistisk insikt i signalering vägar, ge en plattform för storskalig Drug screening, och tillförlitligt modell hjärtsjukdomar.
Abstract
Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs) ger en värdefull mänsklig källa för att studera den grundläggande vetenskapen om kalcium (ca2 +) hantering och signalering vägar samt hög genomströmning Drug screening och toxicitetsanalyser. Häri ger vi en detaljerad beskrivning av de metoder som används för att generera högkvalitativa iPSC-CMs som konsekvent kan reproducera molekylära och funktionella egenskaper mellan olika cellinjer. Dessutom beskrivs en metod för att tillförlitligt bedöma deras funktionella karaktärisering genom utvärderingen av ca2 + hanteringsegenskaper. Låg syre (O2) villkor, laktat urval, och långvarig tid i kulturen producera hög renhet och högkvalitativa ventrikulär-liknande kardiomyocyter. Liknar isolerade vuxna råtta kardiomyocyter (ARCMs), 3-månaders-gamla iPSC-CMs uppvisar högre ca2 + amplitud, snabbare ca2 + återupptaget (Decay-Tau), och en positiv lusitropic svar på β-adrenerga stimulering jämfört med dag 30 IPSC-CMS. Strategin är tekniskt enkel, kostnadseffektiv och reproducerbar. Det ger en robust plattform för att modellera hjärtsjukdom och för storskalig läkemedels screening för att rikta ca2 + hantera proteiner.
Introduction
Humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda kardiomyocyter (IPSC-CMS) är en attraktiv Human-baserad plattform för att modellera en stor variation av hjärtsjukdomar in vitro-1,2,3,4,5,6,7,8. Dessutom kan IPSC-CMS användas för förutsägelse av patientens svar på nya eller befintliga läkemedel, att Screen träff föreningar, och utveckla nya personliga droger9,10. Men trots betydande framsteg, flera begränsningar och utmaningar måste övervägas när du använder iPSC-CMs11. Följaktligen, metoder för att förbättra hjärt differentiering protokoll, för att förbättra IPSC-CMS effektivitet och mognad, och för att generera specifika kardiomyocyte subtyper (ventrikulär, förmaksflimmer, och nodal) har intensivt studerats och redan lett till många kultur strategier för att övervinna dessa hinder12,13,14,15.
Oaktat robustheten hos dessa protokoll är ett stort bekymmer för användningen av iPSC-CMs reproducerbarheten av långa och komplicerade förfaranden för att erhålla högkvalitativa kardiomyocyter som kan säkerställa samma prestanda och reproducerbara resultat. Reproducerbarhet är kritisk inte bara när man jämför cellinjer med olika genetiska bakgrunder, men också när man upprepar cellulära och molekylära jämförelser av samma cell linje. Cell variation, såsom väl till väl skillnader i iPSCs densitet, kan påverka hjärt differentiering, genererar en låg avkastning och dålig kvalitet kardiomyocyter. Dessa celler kan fortfarande användas för att utföra experiment som inte kräver en ren population av CMs (t. ex. vid utförande av ca2 + transienta mätningar). Faktum är att när du utför elektrofysiologiska analys, icke-CMs kommer inte att slå, varken spontant eller under elektrisk stimulering, så det kommer att bli lätt att utesluta dem från analysen. Men på grund av dålig kvalitet, iPSC-CMs kan visa förändrade elektrofysiologiska egenskaper (t. ex., oregelbunden ca2 + övergående, låg ca2 + amplitud) som inte beror på deras genetiska makeup. Därför, särskilt när du använder iPSC-CMs för att modellera hjärtsjukdom, det är viktigt att inte förväxla resultat från en dålig kvalitet CM med sjukdomen fenotyp. Noggranna screening-och uteslutnings processer krävs innan man går vidare till elektrofysiologiska studier.
Denna metod innehåller optimerade protokoll för att generera hög renhet och högkvalitativa kardiomyocyter och för att bedöma deras funktion genom att utföra ca2 + transienta mätningar med hjälp av ett kalcium och kontraktilitet förvärvs-och analyssystem. Denna teknik är en enkel, men ändå kraftfull, sätt att skilja mellan hög verkningsgrad och låg verkningsgrad iPSC-CM preparat och ge en mer fysiologiskt relevant karakterisering av mänskliga iPSC-CMs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg för att använda humant iPSC-CMs som experimentella modeller är: 1) generera högkvalitativa kardiomyocyter (CMs) som kan säkerställa konsekvent prestanda och reproducerbara resultat; 2) tillåta cellerna att mogna i kulturen under minst 90 dagar för att på ett adekvat sätt bedöma deras fenotyp; 3) utföra elektrofysiologiska studier, t ex kalcium (ca2 +) transienta mätningar, för att ge en fysiologiskt relevant funktionell karakterisering av humant IPSC-CMS. Vi utvecklade en monolayer-…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av AHA vetenskapsman Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award för klinisk och translationell forskarkarriär utveckling KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 och AHA 18TPA34170460 (C.K.).
Materials
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
Referências
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
- Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
- Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
- Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
- Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
- Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
- Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
- Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).
