Ventriküler Benzeri HiPSC Türevi Kardiyomiyositlerin Ve Kalsiyum Kullanımı Karakterizasyonu için Yüksek Kaliteli Hücre Preparatlarının Üretimi
Summary
Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.
Abstract
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) kalsiyum temel bilim (Ca2 +) işleme ve sinyal yollarının yanı sıra yüksek iş gücü ilaç tarama ve toksisite tahlilleri eğitimi için değerli bir insan kaynağı sağlar. Burada, farklı hücre hatlarında moleküler ve işlevsel özellikleri sürekli olarak üretebilen yüksek kaliteli iPSC-CM’ler üretmek için kullanılan metodolojilerin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Ayrıca, Ca2+ işleme özelliklerinin değerlendirilmesi yoluyla işlevsel karakterizasyonlarını güvenilir bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem tanımlanır. Düşük oksijen (O2)koşulları, laktat seçimi ve kültürde uzun süreli yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli ventriküler benzeri kardiyomiyositler üretir. İzole yetişkin sıçan kardiyomiyositlerine (ARCM) benzer şekilde, 3 aylık iPSC-CM’ler daha yüksek Ca2+ genlik, daha hızlı Ca2+ geri alım oranı (bozunma-tau) ve 30 gün iPSC-CM’lere göre β-adrenerjik stimülasyona pozitif lusitropik yanıt sergiler. Strateji teknik olarak basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir. Bu kardiyak hastalığı modellemek için sağlam bir platform sağlar ve büyük ölçekli ilaç tarama hedef Ca2 + işleme proteinleri.
Introduction
İnsan indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) in vitro1,2,3,4,5,6,7,8kalp hastalıklarının büyük bir çeşitlilik modellemek için çekici bir insan tabanlı platformvardır. Ayrıca, iPSC-CMs yeni veya mevcut ilaçlara hasta yanıtlarının tahmin için kullanılabilir, vurmak bileşikleri ekrana, ve yeni kişiselleştirilmiş ilaçlar geliştirmek9,10. Ancak, önemli ilerleme rağmen, çeşitli sınırlamalar ve zorluklar iPSC-CMs11kullanırken dikkate alınması gerekir. Sonuç olarak, yöntemleri kardiyak farklılaşma protokolleri geliştirmek için, iPSC-CMs verimliliği ve olgunlaşma geliştirmek için, ve spesifik kardiyomiyosit alt türleri oluşturmak için (ventriküler, atriyal, ve nodal) yoğun olarak incelenmiş ve zaten bu engelleri aşmak için çok sayıda kültür stratejileri yol açtı12,13,14,15.
Bu protokollerin sağlamlığına rağmen, iPSC-CM’lerin kullanımı için önemli bir endişe, aynı performansı ve tekrarlanabilir sonuçları sağlayabilen yüksek kaliteli kardiyomiyositler elde etmek için uzun ve karmaşık prosedürlerin tekrarlanabilirliğidir. Tekrarlanabilirlik sadece farklı genetik arka planlar ile hücre hatları karşılaştırırken değil, aynı zamanda aynı hücre hattının hücresel ve moleküler karşılaştırmalar tekrarlanırken önemlidir. Hücre değişkenliği, örneğin iPSCs yoğunluğundaki iyi-iyi farklılıklar, kardiyak farklılaşmayı etkileyerek düşük verim ve düşük kaliteli kardiyomiyositler üretebilir. Bu hücreler hala saf cm popülasyonu gerektirmeyen deneyler yapmak için kullanılabilir (örneğin, Ca2+ geçici ölçümler icra ederken). Gerçekten de, elektrofizyolojik analiz yaparken, olmayan CM’ler ne kendiliğinden ne de elektriksel stimülasyon altında yenmez, bu nedenle onları analizden dışlamak kolay olacaktır. Ancak, kalitesiz olması nedeniyle, iPSC-CM’ler genetik yapısına bağlı olmayan değiştirilmiş elektrofizyolojik özellikleri (örneğin, düzensiz Ca2+ geçici, düşük Ca2+ genliği) gösterebilirler. Bu nedenle, özellikle kalp hastalığı modellemek için iPSC-CMs kullanırken, hastalık fenotip ile düşük kaliteli CM sonuçları karıştırmak için önemlidir. Elektrofizyolojik çalışmalara devam edilmeden önce dikkatli tarama ve dışlama işlemleri gereklidir.
Bu yöntem, yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli kardiyomiyositler üretmek ve kalsiyum ve kontraktillik edinimi ve analiz sistemi kullanarak Ca2+ geçici ölçümler yaparak işlevlerini değerlendirmek için optimize edilmiş protokolleri içerir. Bu teknik, yüksek verimlilik ve düşük verimli iPSC-CM preparatları ayırt etmek ve insan iPSC-CM’lerin fizyolojik olarak daha alakalı bir karakterizasyonu sağlamak için basit, ama güçlü bir yoldur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneysel modeller olarak insan iPSC-CMs kullanmak için kritik adımlar şunlardır: 1) tutarlı performans ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabilir yüksek kaliteli kardiyomiyositler (CMs) üreten; 2) hücrelerin en az 90 gün boyunca kültür içinde olgunlaşmasına izin vererek fenotiplerini yeterince değerlendirmek; 3) insan iPSC-CM’lerinin fizyolojik olarak ilgili fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamak için kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümler gibi elektrofizyolojik çalışmalar yapmak. Yüksek kal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.) tarafından desteklenmiştir; Mount Sinai KL2 Bilim Adamları Klinik ve Çevirisel Araştırma Kariyer Geliştirme KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ve AHA 18TPA34170460 (K.K.).
Materials
| Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal | Sigma Aldrich | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti rabbit | Invitrogen | A21428 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| B27(-) insulin Supplement | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI nuclear stain | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well | Corning | 353046 | |
| Fluidic inline heater | Live Cell Instrument | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | Matrigel Matrix |
| hPSC media | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | EC-B25 | |
| MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody | Synaptic Systems | 311011 | |
| Myocyte calcium and contractility system | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane | ThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS with Calcium and Magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| PBS without Calcium and Magensium | Corning | 21-031-CV | |
| Premium Glass Cover Slips | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | |
| StemFlex Supplement | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Tyrode's solution | Boston Bioproducts | BSS-355w | Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride |
Referências
- Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
- Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
- Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
- Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
- Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
- Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
- Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
- Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
- Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
- Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
- Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
- Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).
