इन विट्रो लिखित एमआरएनए के साथ प्राथमिक मैक्रोफेज का अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन
Summary
मैक्रोफेज, विशेष रूप से प्राथमिक मैक्रोफेज, ट्रांसफेट करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि वे गैर-स्व उत्पत्ति के अणुओं का पता लगाने में विशेषज्ञ हैं। हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो प्लाज्मिड जैसे डीएनए टेम्पलेट्स से उत्पन्न एमआरएनए के साथ प्राथमिक मैक्रोफेज के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन की अनुमति देता है।
Abstract
मैक्रोफेज गैर-आत्म मूल के अणुओं का पता लगाने में विशेषज्ञता वाले फागोसाइटिक कोशिकाएं हैं। इस उद्देश्य के लिए, वे पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर) की एक बड़ी सरणी से लैस हैं। दुर्भाग्य से, यह मैक्रोफेज को विशेष रूप से ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान और ट्रांस्फन्यूलिक एसिड के रूप में ट्रांसफेक्ट करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है, जिसे अक्सर पीआरआरएस द्वारा गैर-स्व के रूप में मान्यता दी जाती है। इसलिए, ट्रांसफेक्शन के परिणामस्वरूप अक्सर मैक्रोफेज सक्रियण और ट्रांस्फन्यूलिक एसिड या यहां तक कि मैक्रोफेज की आत्महत्या में भी गिरावट आती है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) और बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) जैसे पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) और बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) जैसे डीएनए टेम्पलेट्स जैसे डीएनए टेम्पलेट्स से लिखित में एमआरएनए के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन की अनुमति देता है। इस सरल प्रोटोकॉल के साथ, पीएम के लिए लगभग 50-65% की ट्रांसफेक्शन दरें और बीएमडीएम के लिए लगभग 85% साइटोटॉक्सिसिटी या इम्यूनोजेनिसिटी के बिना प्राप्त की जाती हैं। हम डीएनए से ट्रांसफेक्शन के लिए एमआरएनए की पीढ़ी का विस्तार से वर्णन करते हैं जैसे प्लाज्मिड्स और ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया।
Introduction
मैक्रोफेज थैलोसाइटिक कोशिकाएं हैं जो रोगाणुओं, अपोप्टिक कोशिकाओं और सेलुलर मलबे का पता लगाने, करने और अपमानजनक करने में विशेषज्ञ हैं। इसके अलावा, वे साइटोकिन्स और केमोकिन्स को स्रावित करके और टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं को एंटीजन पेश करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आर्केस्ट्रा करने में मदद करते हैं। मैक्रोफेज घाव भरने, एथेरोस्क्लेरोसिस, ट्यूमरिजेनेसिस और मोटापे जैसी कई अन्य प्रक्रियाओं में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न (पीम्प्स) और आउट-ऑफ-प्लेस अणुओं जैसे क्षति-संबद्ध आणविक पैटर्न (डीएबीपीएस) जैसे गैर-आत्म अणुओं का पता लगाने में सक्षम होने के लिए, मैक्रोफेज पैटर्न रिकग्निशन रिसेप्टर्स (पीआरआर)1की एक बड़ी सरणी से लैस हैं। दुर्भाग्य से, यह मैक्रोफेज को विशेष रूप से ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थानकर्ता 3 और ट्रांससंक्रमित न्यूक्लिक एसिड4,5,6,7 के रूप में 2 को स्थानांतरित करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है, अक्सर पीआरआरएस द्वारा गैर-स्व के रूप में पहचाना जाता है। इस कारण से, रासायनिक या भौतिक तरीकों का उपयोग करके मैक्रोफेज का अंतरण8 आमतौर पर ट्रांस्रेंट न्यूक्लिक एसिड की मैक्रोफेज सक्रियता और क्षरण या पाइरोप्टोसिस के माध्यम से मैक्रोफेज आत्महत्या में भी होता है, प्रोग्राम किए गए लाइटिक सेल डेथ का एक रूप जो डीएनए या विदेशी आरएनए9जैसे साइटोसोलिक पाम्स/डैम्प्स की मान्यता के बाद शुरू होता है । एडेनोवायरस या लेंटिवायरस जैसे वायरस का उपयोग करके मैक्रोफेज का जैविक ट्रांसफेक्शन अक्सर अधिक कुशल होता है, फिर भी ऐसे वायरल वेक्टर का निर्माण समय लेने वाला होता है और इसके लिए बायोसेफ्टी लेवल 2 उपकरण10,11की आवश्यकता होती है।
इस प्रकार, यद्यपि मैक्रोफेज गहन अनुसंधान का विषय हैं, आणविक स्तर पर उनके कार्यों का विश्लेषण बाधित होता है क्योंकि आणविक जीव विज्ञान के सबसे महत्वपूर्ण उपकरणों में से एक, न्यूक्लिक एसिड का ट्रांसफेक्शन एक्सोजेनस अभिव्यक्ति के लिए निर्माण करता है प्रोटीन, शायद ही लागू होता है। यह अक्सर शोधकर्ताओं को सदाशयी मैक्रोफेज के बजाय मैक्रोफेज जैसी सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए बनाता है। न्यूक्लिक एसिड निर्माण ट्रांसफेक्शन के लिए आवेदनों में उत्परिवर्तित या टैग किए गए प्रोटीन संस्करणों की अभिव्यक्ति, एक विशिष्ट प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति, संबंधित नॉकआउट पृष्ठभूमि में प्रोटीन पुनः अभिव्यक्ति और अन्य प्रजातियों से प्रोटीन की अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए) शामिल हैं। , क्रे को लक्षित जीन नॉकआउट के लिए आरएनए और Cas9 का पुनर्संयोजन या मार्गदर्शन करना) ।
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो प्राथमिक मैक्रोफेज (आमतौर पर ट्रांसफेक्ट करने के लिए कठिन) के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन की अनुमति देता है, जो कि मोनी पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) और बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) है, जिसमें एमआरएनए से उत्पन्न एमआरएनए प्लाज्मिड्स से उत्पन्न होता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न इन विट्रो लिखित एमआरएनए में स्वाभाविक रूप से होने वाले संशोधित न्यूक्लियोसाइड्स 5-मिथाइल-सीटीपी और छद्म-यूटीपी शामिल हैं जो इम्यूनोजेनिसिटी को कम करते हैं और स्थिरताकोबढ़ाते हैं4,6,7,12,13। इसके अलावा, इन विट्रो लिखित एमआरएनए के 5′-सिरों को रिग-1 कॉम्प्लेक्स14,15द्वारा मान्यता को रोकने के लिए अंटार्कटिक फॉस्फेटेज़ द्वारा डिफोस्फेरिकेटेड किया जाता है। यह इन विट्रो लिखित एमआरएनए की जन्मजात प्रतिरक्षा मान्यता को कम करता है। प्रोटोकॉल करने में हमारी आसानी के साथ, 50-65% (पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम)) और 85% (बीएमडीएम) के बीच ट्रांसफेक्शन दरें पहुंच जाती हैं, जबकि महत्वपूर्ण बात यह है कि कोई साइटोटॉक्सिकिटी या इम्यूनोजेनिसिटी नहीं देखी जाती है। हम विस्तार से वर्णन करते हैं (i) कैसे ट्रांसफेक्शन के लिए इम्यूनोलॉजिकल रूप से खामोश एमआरएनए डीएनए निर्माण जैसे प्लाज्मिड्स और (ii) ट्रांसफेक्शन प्रक्रिया से उत्पन्न हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम इन विट्रो लिखित एमआरएनए के साथ आमतौर पर हार्ड-टू-ट्रांसफेट प्राइमरी मैक्रोफेज के अत्यधिक कुशल ट्रांसफेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करक?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमिन्सफ्ट (एसएफबी 670) ने समर्थन दिया था।
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
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| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
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| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
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| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
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| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
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| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
Referências
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