回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離
Summary
ここで、トランスジェニック・カエオルハブ炎エレガンス線から緑色蛍光タンパク質を発現する生きている神経細胞の特定の群を単純に単離するためのプロトコルを提示する。この方法は、特定のニューロンに焦点を当てた様々なex vivo研究を可能にし、さらに短期的な培養のために細胞を分離する能力を有する。
Abstract
老化プロセスの間に, 多くの細胞は、細胞機能障害につながる損傷の高レベルを蓄積します, 多くの老人および病理学的状態の下に.有人性後ニューロンは、加齢の影響を受ける主要な細胞型を表します。神経老化の複数の哺乳類モデルが存在するが、それらは確立するために挑戦的で高価である。回虫のカエモルハブ炎エレガンスは、これらの動物は短い寿命、利用可能な堅牢な遺伝的ツールボックス、およびよくカタログ化された神経系を持っているので、神経老化を研究するための強力なモデルです。本明細書に提示される方法は、トランスジェニック緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に基づいて特定の細胞をシームレスに単離することを可能にする。異なる、細胞型特異的プロモーターの下でGFPを発現するトランスジェニック動物株は、外側のキューティクルを除去するために消化され、様々な細胞タイプを含むスラリーを生成するために穏やかに機械的に破壊される。その後、目的の細胞は、蛍光活性化細胞選別、または抗GFP結合磁気ビーズによって非標的細胞から分離されます。その後、単離された細胞を限られた時間で培養するか、リアルタイム定量PCRによる転写分析などの細胞特異的な生体内分析に直ちに使用することができます。したがって、このプロトコルは、C.エレガンスの異なるニューロン集団内の細胞特異的応答の迅速かつ堅牢な分析を可能にする。
Introduction
過去数十年にわたり、メタゾンモデル生物のカエオルハブ炎エレガンスは、ニューロン、ニューロン回路、生理的および行動的応答におけるその役割、および老化関連神経変性の研究において、多大な財産となっています。病気。C.エレガンスのユニークな特徴は、動物が透明であり、すべての成人体細胞の系統をマッピングできるようにすることです 1.C. エレガンスはまた、神経細胞の管理可能な量を収容し、神経系の形態と接続性がよく理解されている2.C.エレガンスで利用可能な不変細胞系統、短い寿命、および豊富なハイスループット遺伝的ツールは、異なる神経集団内の老化の研究のための理想的なモデル生物を作る。
ニューロンの老化と神経変性疾患は複雑であり、各疾患はそれに関連するユニークな病理学的特徴を有する。しかし、パーキンソン病やアルツハイマー病などのこれらの疾患の多くでは、一般的な特徴は、誤ったたんぱく質3、4、5の進行性負荷である。これらの疾患の両方において、タンパク質は細胞内で誤って折り畳まれ、凝集して毒性を引き起こし、最終的には細胞死4、5につながる。ニューロンの適切な老化のために、ミトコンドリアの恒常性、より具体的にはタンパク質恒常性は、摂動および嚥下障害が神経変性6、7、8を引き起こす可能性があるとして重要である。細胞はタンパク質恒常性を維持するための様々なメカニズムを備え、1つは展開されたタンパク質応答(UPR)である-小球網膜(ER)からのシグナルが細胞内シグナルカスケードを活性化し、転写につながる古典的な経路である。応答9.このUPRERに似て、メタゾンはミトコンドリアタンパク質恒常性の喪失に対して同様の応答を示し、いわゆるミトコンドリアUPR(UPRmt)7,8である。C. エレガンスは、確認され、明確に定義されたUPRmt経路7を持っている最も基底生物であるように見えます.
大規模なネットワーク内の特定のニューロン集団の機能/機能不全は、その本質的な接続性と複雑さ3を評価するのが難しい場合があります。しかし、細胞性タンパク質恒常性障害に関連するものなど、複雑な病理を有する細胞型特異的疾患のために、異なる神経集団を研究する必要が生じることが多い。C.エレガンスでは、特定の神経集団を遺伝的に操作し、生体内での顔の観察を可能にする。C.エレガンスの神経系は、主に神経細胞で構成され、グリア細胞の割合は小さい。成人のヘルマクロダイトワームでは、約302のニューロンがあり、100以上の異なるクラス2、10に細分化されている。コリン作動性ニューロンなどのニューロンは神経筋接会で優勢であり、ドーパミン作動性ニューロンは主に感覚10,11に関与する。運動活動と感覚能力の両方が年齢とともに低下するにつれて、これらの個々のニューロンの欠陥に関する機械的洞察を詳細に述べる必要があります11,12.そのため、その後のex vivo研究のために目的とする無傷の細胞を単離するシンプルで堅牢な方法が必要である。
ここでは、C.エレガンスから緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する特定の神経細胞を迅速に単離するための最適化された有効な方法について説明する。この分離方法は、幼虫、若年性または成人のワームに対して行うことができる。幼虫ワームからの細胞の分離は、以前にZhang et al. al.13によって発表され、ここでは議論されません。ここで重要な注意事項は、すべてのワームが異なるライフステージで動物の過剰消化や動物からの汚染を防ぐために同じライフステージにある必要があることです。線虫キューティクルの酵素および機械的破壊の両方を通じて、コラーゲンおよび他の構造タンパク質の高い外骨格は、多種多様な細胞を単離することができる13、14。細胞は、その後、フローサイトメトリーまたは抗体標識磁気ビーズを介して単離することができる。典型的には、RNAは、所望の細胞集団15の濃縮を確実にするためにフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート法を介して単離される。多くの注意を払って、これらの単離された細胞は、培養フラスコまたはマルチウェル皿で維持することができる。この方法は、特定のニューロンの研究におけるユニークで強力なツールを表し、さらなる培養のための生細胞および機能細胞を分離する能力を有する。
Protocol
Representative Results
Discussion
回虫C.エレガンスは、神経の健康と病気2を研究するための確立された強力なモデルです。これらの動物を操作するための十分な遺伝的ツールと正確にマッピングされた様々なニューロンタイプの管理可能な量を使用すると、比較的少量の材料で大量のデータを収集することができます。ここでは、動物全体から異なるニューロンを分離するための最適化された方法を?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジェニファー・フォックス博士とカリモンチュク研究所のメンバーに、洞察力に満ちたコメントをいただき、感謝します。我々は、国立衛生研究所(R01 GM108975からO.K.およびT32 GM107001-01A1からE.M.G.への支援を認める)。
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
Referências
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Biologia do Desenvolvimento. 100, 64-119 (1983).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).
- Choi, M. L., Gandhi, S. Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease. FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).
- Burman, J. L., et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates. Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).
- Shpilka, T., Haynes, C. M. The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).
- Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans. Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).
- Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
- Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. Neuron aging: learning from C. elegans. Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).
- Germany, E. M., et al. The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis. Journal of Cell Science. 131, jcs219956 (2018).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLOS One. 6 (4), e19505 (2011).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).
- Pereira, L., et al. A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans. eLife. 4, e12432 (2015).
