Isolação de populações específicas do Neuron do elegans da Caenorhabditis da lombriga
Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação simples de grupos específicos de pilhas neuronal vivos que expressam a proteína fluorescente verde das linhas transgênicas dos elegans de Caenorhabditis . Este método permite uma variedade de estudos ex vivo focados em neurônios específicos e tem a capacidade de isolar as células para uma maior cultura de curto prazo.
Abstract
Durante o processo de envelhecimento, muitas células acumulam altos níveis de danos que levam à disfunção celular, que está subjacente a muitas condições geriátricas e patológicas. Os neurônios pós-mitóticos representam um tipo de célula principal afetado pelo envelhecimento. Embora existam vários modelos de mamíferos de envelhecimento neuronal, eles são desafiadores e caros para estabelecer. O lombriga Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para estudar o envelhecimento neuronal, como estes animais têm tempo curto, uma caixa de ferramentas genética robusta disponível, e sistema nervoso bem catalogado. O método aqui apresentado permite a isolação sem emenda de pilhas específicas baseadas na expressão de uma proteína fluorescente verde transgénica (GFP). Linhas de animais transgênicas expressando GFP distintos, os promotores específicos do tipo celular são digeridos para remover a cutícula externa e suavemente interrompidas mecanicamente para produzir chorume contendo vários tipos de células. As células de interesse são então separadas de células não-alvo através de triagem de células ativadas por fluorescência, ou por anti-GFP-acoplado contas magnéticas. As pilhas isoladas podem então ser cultivadas por um tempo limitado ou ser usadas imediatamente para análises ex vivo Cell-specific tais como a análise transcricional pelo PCR quantitativo do tempo real. Assim, este protocolo permite a análise rápida e robusta de respostas Cell-specific dentro das populações neuronal diferentes em C. elegans.
Introduction
Ao longo das últimas décadas, o modelo metazoários organismo Caenorhabditis elegans tem sido um trunfo tremendo no estudo de neurônios, circuitos neuronais e seu papel em respostas fisiológicas e comportamentais, e envelhecimento associado neurodegenerativa Doenças. Uma característica única de C. elegans é que os animais são transparentes, permitindo que a linhagem de todas as células somáticas adultas seja mapeada1. C. elegans também abriga a quantidade gerenciável de neurônios, levando à morfologia e conectividade do sistema nervoso sendo bem compreendido2. A linhagem de células invariantes, o tempo curto e a abundância de ferramentas genéticas de alta produtividade disponíveis para C. elegans fazem dele um organismo modelo ideal para o estudo do envelhecimento dentro de diferentes populações neuronais.
O envelhecimento dos neurônios e as desordens neurodegenerativas são complexos, e cada desordem tem as assinaturas patológicas originais associadas com ela. No entanto, para muitas dessas desordens, como a doença de Parkinson e de Alzheimer, uma característica comum é a carga progressiva de proteínas desdobradas3,4,5. Em ambas as doenças, as proteínas dobram e agregam dentro da célula para causar toxicidade, levando, em última análise, à morte celular4,5. Para o envelhecimento adequado dos neurônios, a homeostase das mitocôndrias, mais especificamente a homeostase proteica, é importante, pois as perturbações e a distonostase podem levar à neurodegeneração6,7,8. As pilhas são equipadas com os vários mecanismos para manter a homeostase da proteína, uma que é a resposta desdobrado da proteína (UPR) ― uma via clássica onde os sinais do retículo endoplasmático (er) ativam cascatas intracelular do sinal, conduzindo a um transcricional a resposta9. Semelhante a este UPRer, metazoários mostrar uma resposta semelhante à perda de homeostase da proteína mitocondrial, o chamado UPR mitocondrial (UPRMT)7,8. C. elegans parece ser o organismo mais basal para teruma via de elevação confirmada e bem definida do RCQ7.
A função/disfunção de populações neuronais específicas dentro de uma rede maior pode ser difícil de avaliar devido à sua conectividade intrínseca e complexidade3. No entanto, muitas vezes há a necessidade de estudar populações neuronais distintas devido a doenças específicas do tipo celular com patologias complexas, como as associadas à homeostase da proteína celular prejudicada. Em C. elegans, populações neuronais específicas podem ser geneticamente manipuladas permitindo a observação facile in vivo. O sistema nervoso de C. elegans consiste principalmente de neurônios, com uma pequena percentagem de células gliais. Em vermes hermafroditas adultos, existem aproximadamente 302 neurônios, subdivididos em mais de 100 classes diferentes2,10. Neurônios como os neurônios colinérgicos predominam nas junções neuromusculares, enquanto os neurônios dopaminérgicos estão principalmente envolvidos na sensação10,11. Como a atividade motora e as habilidades sensoriais diminuem com a idade, é importante detalhar insights mecanísticos sobre defeitos nesses neurônios individuais11,12. Como tal, há uma necessidade para um método simples e robusto isolar pilhas intactas do interesse para estudos ex vivo subseqüentes.
Aqui, nós descrevemos um método eficaz aperfeiçoado para a isolação rápida de pilhas neuronal específicas que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) de C. elegans. Este método de isolamento pode ser realizado em larvas larvares, juvenis ou adultas. A isolação das pilhas dos sem-fins larval foi publicada previamente por Zhang et al.13 e não será discutida aqui. Uma nota importante aqui é que todos os vermes precisam estar no mesmo estágio de vida para evitar a digestão do animal ou a contaminação de animais em diferentes estágios de vida. Através do rompimento enzimático e mecânico da cutícula do nematódeo, um exoesqueleto alto em colágeno e outras proteínas estruturais, uma grande variedade de células pode ser isolada13,14. As pilhas podem então ser isoladas através da citometria do fluxo ou dos grânulos magnéticos etiquetados anticorpo. Tipicamente, o RNA é isolado através de um método do isotiocianato do phenol e do guanidina para assegurar o enriquecimento da população desejada da pilha15. Com muito cuidado estas pilhas isoladas podem ser mantidas em um balão da cultura ou em um prato do multi-poço. Este método representa uma ferramenta única e poderosa no estudo de neurônios específicos e tem a capacidade de isolar células ao vivo e funcionais para uma maior cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
A lombriga C. elegans é um modelo bem estabelecido e poderoso para estudar a saúde neuronal e doença2. Com amplas ferramentas genéticas para manipular esses animais e a quantidade gerenciável de vários tipos de neurônio mapeados precisamente, uma grande quantidade de dados pode ser coletada com uma quantia relativamente pequena de material. Aqui, Delineamos um método otimizado para isolar neurônios distintos de animais inteiros. Interrompendo as proteínas da cutícula externa do…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Jennifer Fox e aos membros do laboratório Khalimonchuk por comentários perspicazes. Reconhecemos o apoio dos institutos nacionais de saúde (R01 GM108975 a O.K. e T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
Referências
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