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Medicina

Generación de un modelo de rata de insuficiencia hepática aguda mediante la combinación de 70% de hepatectomía parcial y paracetamol

Published: November 27, 2019
doi:
10.3791/60146
, , , , , , , , , ,
1National Institute of Immunology, 2Center for Cellular and Molecular Biology

Summary

El modelo animal de insuficiencia hepática aguda desarrollado en el estudio actual presenta una alternativa factible para el estudio de posibles terapias. El modelo actual emplea el efecto combinado de la lesión hepática física y inducida por fármacos y proporciona un período de tiempo adecuado para estudiar el potencial de las nuevas terapias.

Abstract

La insuficiencia hepática aguda (ALF) es una condición clínica causada por varias etiologías que resulta en la pérdida de funciones metabólicas, bioquímicas, sintetizadoras y desintoxicantes del hígado. En la mayoría de los casos de daño hepático irreversible, el trasplante de hígado ortotrópico (OLT) sigue siendo el único tratamiento disponible. Para estudiar el potencial terapéutico de un tratamiento para la ALF, sus pruebas previas en un modelo animal de ALF son esenciales. En el estudio actual, se desarrolló un modelo de ALF en ratas combinando un 70% de hepatectomía parcial (PHx) e inyecciones de paracetamol (APAP) que proporciona una ventana terapéutica de 48 h. La mediana y los lóbulos laterales izquierdos del hígado fueron retirados para extirpar el 70% de la masa hepática y a APAP se le administró 24 h postquirúrgicamente durante 2 días. Se encontró que la supervivencia en animales inducidos por ELA disminuyó gravemente. El desarrollo de ALF fue confirmado por niveles séricos alterados de las enzimas alanina amino transferasa (ALT), aspartato amino transferasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP); cambios en el tiempo de protrombina (PT); y evaluación de la relación internacional normalizada (INR). El estudio del perfil de expresión génica por qPCR reveló un aumento en los niveles de expresión de genes implicados en la apoptosis, inflamación y en la progresión de la lesión hepática. La evaluación histológica observó la degeneración difusa de hepatocitos y la infiltración de células inmunitarias. La reversibilidad de la ALF se confirmó mediante la restauración de la supervivencia y los niveles séricos de ALT, AST y ALP después del trasplante intraesplénico de hepatocitos de ratas sanas singénicas. Este modelo presenta una alternativa fiable a los modelos animales ALF disponibles para estudiar la fisiopatología de ALF, así como para evaluar el potencial de una novedosa terapia para ALF. El uso de dos enfoques diferentes también permite estudiar el efecto combinado de la lesión hepática física y no inducida por drogas. La reproducibilidad y viabilidad del procedimiento actual es una ventaja añadida del modelo.

Introduction

La insuficiencia hepática aguda (ALF) es definida por la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas como un rápido desarrollo de lesión hepática aguda sin ningún signo previo de daño y se caracteriza por un deterioro grave de las funciones sintéticas, metabólicas y desintoxicantes del hígado1. LA ALF difiere de la insuficiencia hepática crónica cuando la insuficiencia se produce como resultado de una lesión hepática causada durante un largo período de tiempo y de insuficiencia hepática crónica aguda (ACLF), donde el daño hepático abrupto tiene lugar como resultado de enfermedades hepáticas crónicas2,3,4. La única cura disponible para la ALF es el trasplante de hígado ortotópico (OLT), o puede ocurrir la muerte. Debido a la escasez de donantes hepáticos, la tasa de mortalidad en pacientes que sufren de ALF es muy alta.

Para estudiar el potencial de los enfoques terapéuticos alternativos y para entender mejor la fisiopatología de la ALF, se necesitan modelos animales que puedan reflejar la ALF que ocurre en los seres humanos. Muchos de los modelos animales ALF ya disponibles tienen varias deficiencias. Los efectos del paracetamol (APAP) son difíciles de reproducir, pero tienen las similitudes más cercanas en términos de parámetros temporales, clínicos, bioquímicos y patológicos. APAP- modelos animales inducidos con frecuencia encuentran problemas debido a la presencia de metahemoglobinemia causada por la oxidación de la hemoglobina por APAP y sus intermedios5,6,7. Otro problema es la falta de reproducibilidad reflejada por respuestas de dosis impredecibles y el momento de la muerte. Los modelos animales ALF producidos con cloruro de tetra carbono (CCl4) tienen una reproducibilidad deficiente8,9,10,11. Los modelos animales ALF inducidos por Concavalina A (Con A) y lipoplysaccharide (LPS) no reflejan el patrón clínico de la enfermedad humana, aunque tienen ventajas en el estudio de los mecanismos celulares implicados en enfermedades hepáticas autoinmunes y en el estudio de la sepsis respectivamente12,13,14,15. Del mismo modo, la tioacetamida (TAA) también requiere biotransformación a un metabolito activo sulfóxido de tioacetamida y muestra la variación de la especie16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produce algunos cambios bioquímicos, metabólicos y fisiológicos similares a ALF pero no es capaz de reflejar toda la condición patológica de ALF20,21,22,23. Ha habido muy pocos intentos de combinar dos o más de estos métodos para desarrollar un modelo de ALF que sea capaz de reflejar el síndrome de ALF de una mejor manera13. Por lo tanto, se requieren más estudios para desarrollar un modelo que pueda reflejar los parámetros de la enfermedad, tenga mejor reproducibilidad y proporcione suficiente tiempo para estudiar los efectos de una intervención terapéutica.

En el estudio actual, se ha creado un modelo alternativo de ALF en ratas combinando los efectos de la hepatectomía parcial (PHx) y dosis más bajas de un reactivo hepatotóxico. APAP tiene un papel bien establecido en la causa de lesiones hepáticas5,24,25. Es un analgésico ampliamente utilizado y es tóxico para el hígado a dosis supraterapéuticas mediante la formación de metabolitos tóxicos. La APAP es la causa de muchas muertes en los países desarrollados. La lesión física causada por la hepatectomía parcial inicia la activación de varios procesos involucrados en la inflamación, así como la regeneración hepática. La inyección del agente hepatotóxico APAP causa un ambiente hostil en el hígado, evitando la proliferación de hepatocitos. Esto reduce el período de estrés en el animal, que cuando se combina con dosis más pequeñas de hepatotoxina, conduce a una mejor reproducibilidad del procedimiento. Por lo tanto, utilizando este modelo, se ha estudiado un efecto combinatorio de dos tipos de lesiones hepáticas. Para caracterizar el modelo animal desarrollado de ALF, se han estudiado parámetros fisiológicos y bioquímicos. La reversibilidad exitosa de la ALF se confirmó mediante el trasplante de hepatocitos de ratas sanas singénes.

Protocol

El procedimiento descrito a continuación ha sido aprobado por el Comité Institucional de ética animal del Instituto Nacional de Inmunología, Nueva Delhi. El número de referencia de serie de la aprobación es IAEC-355/14. 1. Preparación Prepárese para el procedimiento quirúrgico como se describió anteriormente por Das B et al.26. Utilice ratas Wistar endogámicas de 6 a 8 semanas de edad con un peso corporal de 200–250 g. Alimenta…

Representative Results

Porcentaje de supervivencia en modelos animales de ALFLa dosis óptima de APAP para causar ALF en combinación con 70% PHx se estandarizó como 750 mg/kg de peso corporal. El régimen de tratamiento comenzó 24 h después del 70% de PHx, cuando los animales se habían recuperado completamente de la cirugía, y consistía en dos dosis de APAP a intervalos de 24 h. Se observó mortalidad a una tasa del 80% después de la administración de la segunda dosis de APAP, 48 h después de la cirugía. El porc…

Discussion

El desarrollo de un modelo animal adecuado para la ALF es primordial para una mejor comprensión de la patogénesis y la progresión de la ALF. Un modelo animal ALF bien caracterizado también ofrece la oportunidad para el desarrollo y ensayo de nuevos enfoques terapéuticos contra ALF. Se han hecho muchos intentos para desarrollar un modelo clínicamente relevante de ALF6,12,21,23,<…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la subvención básica recibida del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India al Instituto Nacional de Inmunología de Nueva Delhi.

Materials

Acetaminophen (Biocetamol) EG Pharmaceuticals No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA) Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser Tulip, Alto Santracruz, India Screen Maaster 3000 Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution) Win-Medicare; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I) Kartos international; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope Olympus, Japan LX51
Cefotaxime (Taxim®) AlKem; India cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer Sigma; US CLS431752
Collagenase Type I Gibco by Life Technologies 17100-017
Cotton Buds Pure Swabs Pvt Ltd; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet JSD Surgicals, Delhi, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant Sigma; US 6522
Eosin Y solution, alcoholic Sigma; US HT110132
Forceps Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System Ugo Basile; Italy 211000
Glucose Himedia, India GRM077
Hair removing cream (Veet®) Reckitt Benckiser, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's Sigma; US MHS16
Heparin sodium salt Himedia; India RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes Sigma; US H6254
I.V. Cannula (Plusflon) Mediplus, India Ref 1732411420
Insulin Syringes BD; US REF 303060
Isoflurane (Forane®) Asecia Queenborough No B506 Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®) Troikaa Pharmaceuticals Ltd. Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®) Intas Pharmaceuticals Ltd; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight &
curved		 Mercian; England BS-13-8
Micro needle holders straight &
curved		 Mercian; England BS-13-8
Microtome Histo-Line Laboratories, Italy MRS3500
Nylon Thread Mighty; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde Himedia; India GRM 3660
Percoll® GE Healthcare 17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India P3060 No specific Catalog Number
RPMI Himedia; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors Major Surgicals; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT Coral Clinical System, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat Thermo Electron Corporation; US No specific Catalog Number
Sucrose Sigma; US S0389
Surgical Blade No. 22 La Medcare, India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board Locally made No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape 3M India; India 1530-1 Micropore Surgical Tape
Sutures Ethicon, Johnson & Johnson, India NW 5047
Syringes (1ml, 26 G) Dispo Van; India No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper) Philips NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine Braun No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media Himedia; India AT125
Xylazine (Xylaxin®) Indian Immunologicals Limited Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant
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Referências

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Sahay, P., Jain, K., Sinha, P., Das, B., Mishra, A., Kesarwani, A., Sahu, P., Mohan, K. V., Kumar, M. M., Nagarajan, P., Upadhyay, P. Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen. J. Vis. Exp. (153), e60146, doi:10.3791/60146 (2019).
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