हम दो स्तन एपिथेलियल लाइनों, एचसी11 और ईपीएच 4 के भेदभाव प्रेरण के लिए तकनीकों का वर्णन करते हैं। जबकि दोनों को दूध प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए भ्रूण बछड़े सीरम, इंसुलिन और प्रोलैक्टिन की आवश्यकता होती है, EpH4 कोशिकाएं त्रि-आयामी संस्कृति में मैमोस्फीयर में पूरी तरह से अंतर कर सकती हैं। ये पूरक मॉडल भेदभाव और नियोप्लासिया के सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन अध्ययनके लिए उपयोगी हैं।
कैथेरिन सेल भेदभाव के साथ-साथ नियोप्लासिया के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां हम दो माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइनों, एचसी11 और ईपीएच 4 के भेदभाव के शामिल होने की उत्पत्ति और तरीकों का वर्णन करते हैं, और स्तन ग्रंथि विकास और नियोप्लास्टिक परिवर्तन के पूरक चरणों का अध्ययन करने के लिए उनके उपयोग का वर्णन करते हैं।
HC11 माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइन एक गर्भवती Balb/c माउस की स्तन ग्रंथि से उत्पन्न हुई । यह तब अंतर करता है जब भ्रूण बछड़े सीरम और एचydrocortisone युक्त माध्यम में एक प्लास्टिक पेट्री डिश सतह से जुड़े संगम से जुड़ा हुआ है, मैंnsulin और पीrolactin (हिप माध्यम) । इन परिस्थितियों में, एचसी11 कोशिकाएं दूध प्रोटीन का उत्पादन करती हैं, जो स्तनपान कराने वाली मैमरियल एपिथेलियल कोशिकाओं के समान दूध प्रोटीन और मट्टी अम्लीय प्रोटीन (WAP) का उत्पादन करती हैं, और प्रारंभिक स्तन ग्रंथि जैसी संरचनाएं बनाती हैं जिन्हें “गुंबद” कहा जाता है।
EpH4 सेल लाइन अनायास अमर माउस स्तन ग्रंथि एपिथेलियल कोशिकाओं एक गर्भवती Balb/c माउस से अलग से प्राप्त किया गया था । HC11 के विपरीत, EpH4 कोशिकाएं हिप माध्यम में त्रि-आयामी (3 डी) विकास की स्थिति के तहत सुसंस्कृत होने पर स्फेरॉइड (जिसे मैमोस्फेयर भी भी कहा जाता है) में पूरी तरह से अंतर कर सकती हैं। कोशिकाओं को ट्राइप्सिनकिया, 20% मैट्रिक्स में निलंबित किया जाता है जिसमें Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) माउस सारकोमा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन का मिश्रण होता है, जो एक प्लास्टिक पेट्री डिश या मल्टीवेल प्लेट कोटिंग केंद्रित मैट्रिक्स कोटिंग की एक परत के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है, और 10% मैट्रिक्स युक्त हिप मीडियम की परत के साथ कवर किया जाता है। इन परिस्थितियों में, EpH4 कोशिकाएं खोखले स्फेरॉइड बनाती हैं जो एपिकल-बेसल ध्रुवता, एक खोखले लुमेन, और ए-कैसिन और WAP का उत्पादन करती हैं।
इन तकनीकों का उपयोग करते हुए, हमारे परिणामों ने दिखा दिया कि एचसी11 कोशिकाओं के भेदभाव के लिए कैथेरिन/आरएसी सिग्नल की तीव्रता महत्वपूर्ण है । जबकि Rac1 भेदभाव और सक्रिय आरएसीV12 के निम्न स्तर के लिए आवश्यक है भेदभाव में वृद्धि, उच्च आरएसीV12 स्तर ों में अंतर ब्लॉक जबकि नियोप्लासिया उत्प्रेरण । इसके विपरीत, EpH4 कोशिकाएं स्तन एपिथेलियल भेदभाव में पहले के चरण का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो आरएसीV12के निम्न स्तर से भी बाधित होती है।
सामान्य ऊतकों या ट्यूमर में, कोशिकाओं में त्रि-आयामी संगठन में अपने पड़ोसियों के लिए आसंजन के व्यापक अवसर होते हैं, और यह उच्च घनत्व कोशिका विकास द्वारा संस्कृति में नकल की जाती है। सेल-टू-सेल आसंजन मुख्य रूप से कैथेरिन रिसेप्टर्स के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है, जो कोशिका और ऊतक वास्तुकला को परिभाषित करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि हाल ही में यह प्रदर्शित किया गया था कि कैडेरिन सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन में भी एक शक्तिशाली भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से अस्तित्व संकेत1में। विडंबना यह है कि कैडेरिन से निकलने वाले इन सेल-टू-सेल आसंजन संकेतों में से कुछ को हाल ही में भेदभाव और नियोप्लासिया2दोनों द्वारा साझा किया गया था। यहां, हम दो प्रतिनिधि प्रकार के माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइनों, एचसी11 और ईपीएच 4 में भेदभाव के शामिल होने और मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन करते हैं।
HC11 माउस स्तन एपिथेलियल सेल लाइन एपिथेलियल सेल भेदभाव के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान कर सकती है। HC11 कोशिकाओं को एक अल्पा-1D-व्युत्पन्न सेल लाइन, एक मध्य गर्भवती Balb/c माउस3की स्तन ग्रंथि से उद्भव कर रहे हैं । अन्य कॉमा-1डी व्युत्पन्न क्लोन के विपरीत, एचसी11 क्लोन में लैक्टोजेनिक हार्मोनद्वाराएंडोजेनस-कैसिन जीन के इन विट्रो इंडक्शन के लिए अन्य सेल प्रकारों के साथ एक्सोजेनोस रूप से अतिरिक्त रूप से अतिरिक्त मैट्रिक्स या सहखेती के लिए कोई आवश्यकता नहीं है। इस सेल लाइन का उपयोग विभेदन अध्ययनों में बड़े पैमाने पर किया गया है क्योंकि इसने सामान्य स्तन एपिथेलियम की महत्वपूर्ण विशेषताओं को बनाए रखा है: एचसी11 कोशिकाएं एक स्पष्ट मैमेरी फैट पैड4में डक्टल एपिथेलियम का आंशिक रूप से पुनर्गठन कर सकती हैं। इसके अलावा, वे एक दो आयामी (2डी) संस्कृति में अंतर कर सकते हैं जब एकस्टेरॉयड जैसे एच ydrocortisone या Dexamethasone की उपस्थिति में प्लास्टिक पेट्री डिश सतह से जुड़े संगम के लिए हो, मैंnsulin और पीrolactin (हिप माध्यम) के अलावा एपिडर्मल विकास कारक (EGF), भेदभाव5,6,7के एक अवरोधक की कमी है । इन परिस्थितियों में, एचसी11 कोशिकाएं दूध प्रोटीन जैसे केसिन और WAP का उत्पादन करती हैं, जो प्रेरण के बाद 4 दिनों के भीतर पश्चिमी दाग द्वारा पता लगाने योग्य हैं। साथ ही, एचसी11 कोशिकाओं का एक हिस्सा प्रारंभिक मैममैरी ग्रंथि जैसी संरचनाओं का रूप है, जिन्हें स्टोचस्टिक तरीके से “गुंबद” कहा जाता है। डोम्स इंडक्शन के बाद 4-5 दिन दिखाई देते हैं और धीरे-धीरे 10 दिन तक आकार में वृद्धि करते हैं, उत्पादन8में वृद्धि के साथ सहवर्ती होते हैं। दिलचस्प बात यह है कि एचसी11 कोशिकाओं में उत्परिवर्ती p539है, और इसलिए एक पूर्वनवजात राज्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस कारण से, एचसी11 मॉडल आदर्श रूप से एक ही सेल सिस्टम में नियोप्लासिया के साथ संयोजन के रूप में भेदभाव के सिग्नलिंग नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है।
EPH4 कोशिकाओं, आईएम-2 कोशिकाओं के एक व्युत्पन्न, एक nontumorigenic सेल लाइन मूल रूप से अनायास अमर माउस स्तन ग्रंथि एपिथेलियल कोशिकाओं से प्राप्त एक मध्य गर्भवती Balb/c माउस10से अलग कर रहे हैं । EpH4 कोशिकाएं 2 डी संस्कृति में निरंतर एपिथेलियल मोनोलेयर बनाती हैं, लेकिन ग्रंथि जैसी संरचनाओं10,11में अंतर नहीं करती हैं। हालांकि, ईएचएस माउस सारकोमा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित एक्सपेरिसेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के मिश्रण से युक्त सामग्री में 3 डी वृद्धि के बाद12 (ईएचएस मैट्रिक्स, मैट्रिक्स, या मैट्रिक्स, सामग्री की तालिकादेखें), हिप के साथ उत्तेजना के अलावा, EpH4 कोशिकाएं मैरी ग्रंथि अंतर के प्रारंभिक चरणों को फिर से तैयार कर सकती हैं। इन परिस्थितियों में, EpH4 कोशिकाएं स्फेरॉइड (जिसे मैमोस्फीयर भी कहा जाता है) बनाती हैं जो एपिकल-बेसल ध्रुवता और एक खोखले लुमेन को प्रदर्शित करती हैं, और स्तनपान कराने वाली मैमेरी एपिथेलियल कोशिकाओं के समान दूध प्रोटीन को बनाने में सक्षम हैं। HC11 कोशिकाओं के विपरीत, जो अविभेदित हैं, और कुछ व्यक्त मेसेनचिमल मार्कर13,EpH4 कोशिकाओं को एक विशुद्ध रूप से चमकदार आकृति विज्ञान14प्रदर्शित करते हैं । ईपीएच4 कोशिकाओं को भी dexamethasone, इंसुलिन, और प्रोलैक्टिन15के साथ उत्तेजना के माध्यम से 2 डी संस्कृति में दूध प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए सूचित किया गया है । हालांकि, यह दृष्टिकोण नियामक प्रभावों के अध्ययन को पहले से ही रोकता है जो 3 डी संस्कृति में स्तन ग्रंथि और माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करते हैं।
HC11 कोशिकाएं आदर्श रूप से नियोप्लास्टिक परिवर्तन के साथ भेदभाव के अध्ययन के लिए अनुकूल हैं। एक अतिरिक्त लाभ यह है कि एचसी11 कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के जीन व्यक्त करने के लिए मो-एमएलवी-आधारित रेट्रोवायर?…
The authors have nothing to disclose.
एचसी11 सेल लाइन कृपया डॉ डी मदीना (ह्यूस्टन, TX) द्वारा प्रदान की गई थी । लेखक कई अभिकर्मकों और मूल्यवान सुझावों के लिए रानी विश्वविद्यालय के डॉ एंड्रयू क्रेग के आभारी हैं । EpH4 कोशिकाओं डॉ सी Roskelley (UBC, वैंकूवर) से एक उपहार थे । कोलीन Schick 3 डी संस्कृति अध्ययन के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान की है।
कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), कनाडा के स्तन कैंसर फाउंडेशन (CBCF, ओंटारियो अध्याय), कनाडा के स्तन कैंसर अनुसंधान एलायंस की वित्तीय सहायता , ओंटारियो उत्कृष्टता के केंद्रों, स्तन कैंसर कार्रवाई किंग्स्टन (BCAK) और CLARE नेल्सन वसीयत कोष एलआर को अनुदान के माध्यम से कृतज्ञता से स्वीकार किया है । CIHR, CBCF, BCAK और कैंसर रिसर्च सोसायटी इंक PTG से अनुदान समर्थन प्राप्त हो एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी, कनाडा के फाउंडेशन फॉर इनोवेशन, CIHR, NSERC और कनाडा के कैंसर सोसायटी द्वारा समर्थित है । एमएन को एनएससी से ट्रांसडिसिप्लिनरी कैंसर रिसर्च में टेरी फॉक्स ट्रेनिंग प्रोग्राम से एक छात्रता और क्वीन यूनिवर्सिटी से डीन अवार्ड का समर्थन मिला था । एमजी अमेरिकी सेना स्तन कैंसर कार्यक्रम, ओंटारियो प्रांत के अनुसंधान और नवाचार मंत्रालय और रानी विश्वविद्यालय की सलाहकार अनुसंधान समिति से पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित था । VH एक CBCF डॉक्टरेट फैलोशिप और CIHR के साथ साझेदारी में ट्रांसडिसिप्लिनरी कैंसर रिसर्च में टेरी फॉक्स फाउंडेशन प्रशिक्षण कार्यक्रम से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित था । Hanad Adan एक NSERC ग्रीष्मकालीन छात्रता के प्राप्तकर्ता थे । बी एस को क्वीन यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट अवॉर्ड का सपोर्ट मिला ।
30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |