Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Resumo

Aqui, descrevemos um método de micro-aspiração de célula única para a separação de amebae infectada. A fim separar subpopulações virais no vermiformis de Vermamoeba contaminado por Faustoviruses e por vírus gigantes desconhecidos, nós desenvolvemos o protocolo detalhado abaixo e demonstramos sua habilidade de separar dois vírus gigantes novos low-abundance.

Resumo

Durante o processo de cocultura de ameba, mais de um vírus pode ser isolado em um único poço. Previamente resolvemos esse problema por diluição final e/ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS) aplicada à população viral. No entanto, quando os vírus na mistura têm propriedades morfológicas semelhantes e um dos vírus se multiplica lentamente, a presença de dois vírus é descoberta na fase de montagem do genoma e os vírus não podem ser separados para maior caracterização. Para resolver este problema, desenvolvemos um procedimento de micro-aspiração de célula única que permite a separação e clonagem de vírus altamente semelhantes. No presente trabalho, apresentamos como essa estratégia alternativa nos permitiu separar as pequenas subpopulações virais de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, vírus gigantes que crescem lentamente e não levam à lúse amebal em comparação com o lytic e o rápido crescimento Faustovírus. O controle da pureza foi avaliado pela amplificação específica do gene e os vírus foram produzidos para uma caracterização mais adicional.

Introdução

Os vírus nucleocitoplasmic do ADN grande (NCLDV) são extremamente diversos, definidos por quatro famílias que infectam eucariontes^1. Os primeiros vírus descritos com genomas acima de 300 kbp foram Phydcodnaviridae,incluindo paramecium bursaria chlorella vírus 1 PBCV1². O isolamento e a primeira descrição do Mimivirus mostraram que o tamanho dos vírus dobrou em termos do tamanho da partícula (450 nm) quanto do comprimento do genoma (1,2 Mb)³. Desde então, muitos vírus gigantes foram descritos, geralmente isolados usando um procedimento de cocultura de ameba. Vários vírus gigantes ....

Protocolo

1. Cultura ameba

1. Use vermiformis de Vermamoeba (tensão CDC19) como uma sustentação da pilha.
2. Adicione 30 mL de protease-peptone-levedura extrato-glicose médio (PYG) (Tabela 1) e 3 mL da amebae em uma concentração de 1 x 10⁶ células / mL em um frasco de cultura de 75 cm² células.
3. Mantenha a cultura a 28 °C.
4. Após 48 h, quantificar a amebae usando lâminas de contagem.
5. Para enxaguar, colher as células a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL e pelota a amebae por centrífuga a 720 x g por 10 minutos. Retire o supernatant e resuspenda a pelota no volume apro....

Resultados

A micro-aspiração de célulaúnica é um processo de micromanipulação otimizado neste manuscrito (Figura 1). Esta técnica permite a captura de uma ameba arredondada e infectada (Figura 2A)e seu lançamento em uma placa nova contendo amebae não infectada (Figura 2). É um protótipo funcional que se aplica ao sistema de co-cultura e isolou com sucesso vírus gigantes não líticos. Esta abordagem foi usada pela primeira vez n.......

Discussão

A duração do manuseio de micro-aspiração de célula única e seu bom funcionamento é dependente do operador. As diferentes etapas do experimento requerem precisão. O uso dos componentes de micromanipulação da estação de trabalho deve estar controle constante observando o processo de micro-aspiração e a liberação da célula. O acompanhamento por observação microscópica é necessário para captura e transferência de uma célula. Um operador experiente pode levar de 1 a 2 h para isolar 10 células e retransferi-las uma a uma, depe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Controle as células durante o processo de microaspiração
Frascos de cultura de células Corning 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Cultura
Frascos de cultura de células Corning 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Cultura
Frascos de cultura de células Corning 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Cultura
DFC 425C câmera	LEICA	Unkown	Observação/Monitoramento
Eclipse TE2000-S Microscópio Invertido	Nikon	Unkown	Observação/Monitoramento
EZ1 avançado XL	Quiagen	9001874	extração de DNA
Glasstic Slide 10 com Grades de Contagem	Kova International	87144E	Contagem de células
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	PCR padrão
Microcapilar 20 µ m	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiração e liberação de células
Micromanipulador InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Posicionamento microcapilar
Água livre de nuclease	ThermoFischer	AM9920	PCR padrão
Optima XPN Ultracentrífuga	BECKMAN COULTER	A94469	Purificação de vírus
Placa de Petri 35 mm	Ibidi	81158	Cultura/observação
Filtros de seringa estéreis 5 µ m	Filtração	SLSV025LS	Sigma-aldrich
SYBR verde Tipo I	Invitrogen	desconhecido	Sondas moleculares fluorescentes/citometria de fluxo
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	PCR padrão; Coloração de gel de DNA
Tecnai G20	FEI		Desconhecido Microscopia eletrônica
Tipo 70 Ti Rotor de titânio de ângulo fixo	BECKMAN COULTER	337922	Tubo
ultra-transparente, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Purificação de vírus