Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen
Summary
Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.
Abstract
Selbst in Ermangelung antiretroviraler Medikamente werden nur 15 % der Säuglinge infiziert, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, was auf eine starke schützende Wirkung der Muttermilch (BM) hindeutet. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter keine Einstellung des Stillens. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich zusammen, um die BM-Übertragung zu reduzieren. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, was jedoch weitgehend unklar bleibt, ist der Beitrag dieser Zellen zu den antiviralen Qualitäten von BM. Antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP), eine der essentiellen und durchdringendsten angeborenen Immunantworten, durch BM-Phagozyten gegen HIV-Ziele. Die Zellen wurden aus 5 menschlichen BM-Proben isoliert, die in verschiedenen Stadien der Laktation gewonnen wurden. Die Isolierung erfolgte durch sanfte Zentrifugation, gefolgt von einer sorgfältigen Entfernung von Milchfett und wiederholtem Waschen des Zellpellets. Fluoreszierende Perlen, die mit DEM Epitop hiv-hüllt waren, wurden als Ziele für die Analyse von ADCP verwendet. Die Zellen wurden mit dem CD45-Oberflächenmarker befleckt, um Leukozyten zu identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die ADCP-Aktivität über Kontrollexperimenten signifikant war und reproduzierbar mit einem HIV-spezifischen Antikörper 830A messbar war.
Introduction
Muttermilch (BM) besteht aus mütterlichen Zellen, die >90% lebensfähig sind1. Die Zellzusammensetzung wird stark durch das Stadium der Stillzeit, den Gesundheitszustand von Mutter und Kind und die individuelle Variation beeinflusst, die nach wie vor wenig verstanden wird1,2,3,4. Da BM 103€105 Leukozyten/ml enthält, kann geschätzt werden, dass gestillte Säuglinge täglich 105x 108 mütterliche Leukozyteneinnehmen. Verschiedene In-vivo-Studien haben gezeigt, dass mütterliche Leukozyten dem Säugling eine kritische Immunität bieten und weit über diese Orte der Erstaufnahme hinaus funktionieren5,6,7,8 ,9,10,11. Alle mütterlich abgeleiteten Zellen, die vom Säugling aufgenommen werden, haben das Potenzial, Nebenfunktionen neben dem Säugling samt Leukozyten auszuführen oder zu kompensieren12.
Die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) des humanen Immundefizienzvirus (HIV) bleibt in ressourcenbegrenzten Ländern eine Krise. Da Durchfall- und Atemwegserkrankungen für eine erhebliche Sterblichkeitsrate bei Säuglingen in ressourcenbegrenzten Ländern verantwortlich sind und diese Krankheiten durch exklusives Stillen deutlich reduziert werden, sind die Vorteile für HIV-infizierte Mütter von Stillen weit überwiegt die Risiken13,14,15. Sofern der Zugang zu sauberem Wasser und geeigneter Säuglingsnahrung nicht zuverlässig ist, empfiehlt die WHO für HIV-infizierte Mütter16keine Einstellung des Stillens. Jährlich treten ca. 100.000 MTCTs über BM auf; doch, nur 15% der Säuglinge gestillt von ihren HIV-infizierten Müttern infiziert, was auf eine starke Schutzwirkung von BM17,18,19,20,21. Zahlreiche Faktoren arbeiten wahrscheinlich im Tandem, um eine Übertragung zu verhindern. Wichtig ist, dass HIV-spezifische Antikörper (Abs) in BM mit reduziertem MTCT und/oder reduziertem Tod von Säuglingen durch HIV-Infektion korreliert wurden22,23. Weitgehend unklar bleibt der Beitrag des zellulären Anteils von BM zu seinen antiviralen Qualitäten.
Viele Abs ermöglichen eine Vielzahl antiviraler Aktivitäten, die durch die “konstante” Region des Immunglobulinmoleküls, das kristallisierbare Fragment (Fc), über die Interaktion mit Fc-Rezeptoren (FcRs) vermittelt werden, die auf praktisch allen angeborenen Immunzellen gefunden werden, von denen praktisch alle finden sie in human BM24. Die antikörperabhängige zelluläre Phagozytose (ADCP) wurde als notwendig für die Clearance von Virusinfektionen nachgewiesen und im Falle der Prävention von MTCT von HIV25,26,27, 28 , 29. Angesichts des Mangels an Wissen über den potenziellen Beitrag der ADCP-Aktivität durch BM-Phagozyten zur Prävention von MTCT von HIV, wollten wir eine strenge Methode entwickeln, um Zellen aus menschlichen BM zu isolieren, um eine Studie über ADCP durchzuführen, die von Zellen aus BM in verschiedenen Stadien der Laktation erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Strömungszytometrie-basierte Technik zur Messung der ADCP-Aktivität wurde erstmals 201130 beschrieben und hat sich seitdem als robust erwiesen und in mehr als 80 Studien zitiert. Das hier beschriebene Protokoll passt diese Technik erstmals für die Verwendung mit primären BM-Zellen an. Frühere Studien über die Fc-vermittelte Funktionalität durch BM-Zellen beschränkten sich weitgehend auf die Messung oxidativer Ausbrüche oder histologiebasierte Phagozytose-Assays mit Z…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Susan Zolla-Pazner in der Abteilung für Medizin und Abteilung für Mikrobiologie an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai für die Manuskriptüberprüfung. Das NIH/NICHD stellte Mittel für dieses Projekt unter der Fördernummer R21 HD095772-01A1 bereit. Darüber hinaus wurde R. Powell durch Mittel des Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine am Mount Sinai unterstützt.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
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