Um ensaio à base de fluorescência para caracterização e quantificação da formação de gotas lipídicas em organóides intestinais humanos
Summary
Este protocolo descreve um ensaio para a caracterização da formação do gota do lipido (LD) em organóides intestinais humanos em cima da estimulação com ácidos gordos. Nós discutimos como este ensaio é usado para a quantificação da formação do LD, e como pode ser usado para a seleção elevada da taxa de transferência para as drogas que afetam a formação do LD.
Abstract
Os lipídios dietéticos são tomados como ácidos graxos livres (FAs) pelo epitélio intestinal. Estes FAS são convertidos intracelularmente em moléculas do triglicérides (TG), antes que estejam empacotados em quilomícrons para o transporte à linfa ou em gotas de lipido citosólico (LDS) para o armazenamento intracelular. Um passo crucial para a formação de LDs é a atividade catalítica das aciltransferases de diacilglicerol (DGAT) na etapa final da síntese de TG. Os LDs são importantes para a reserva de espécies lipídicas tóxicas e regulam o metabolismo celular em diferentes tipos de células. Uma vez que o epitélio intestinal humano é regularmente confrontado com altas concentrações de lipídios, a formação de LD é de grande importância para regular a homeostase. Aqui nós descrevemos um ensaio simples para a caracterização e a quantificação da formação do LD (LDF) em cima da estimulação com o ácido gordo insaturado o mais comum, ácido oleico, em organoids intestinais humanos. O ensaio LDF é baseado no corante fluorescente específico LD LD540, que permite a quantificação de LDs por microscopia confocal, leitor de placas fluorescentes ou citometria de fluxo. O ensaio de LDF pode ser usado para caracterizar a formação do LD em pilhas epithelial intestinais humanas, ou para estudar as desordens humanas (genéticas) que afetam o metabolismo do LD, tal como a deficiência DGAT1. Além disso, este ensaio pode igualmente ser usado em um encanamento da elevado-produção para testar os compostos terapêuticos novos, que restauram defeitos na formação do LD em intestinal ou em outros tipos de organoids.
Introduction
Os lipídios são um componente crucial da dieta humana e desempenham um papel importante no armazenamento de energia sistêmica e metabolismo. Quando ingeridos, os lipídios dietéticos são degradados em ácidos graxos livres (FFAs) e monoglicerídeos (MGs) por lipases pancreáticos. Estes substratos são então tomados pelos enterócitos do epitélio intestinal, onde são primeiro re-esterificados a diglicerídeos (DG) por monoglicerídeos aciltransferases (MGAT) enzimas e, posteriormente, a triglicérides (TG) por diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT1)1. Finalmente, estes TGS são integrados em ambos os quilomícrons para a exportação ao sistema de linfa ou às gotas de lipido citosólico (LDS) para o armazenamento intracelular2,3. Embora os quilomícrons sejam necessários distribuir lipídios dietéticos a outros órgãos, a importância do armazenamento gordo intracelular nos LDS não é completamente desobstruída. No entanto, os LDs têm sido mostrados para executar uma função reguladora no intestino, como eles lentamente liberar lipídios na circulação até 16 h após uma refeição4. Além disso, os LDS foram mostrados para proteger de encontro às concentrações tóxicas do ácido gordo, como em adipócitos do rato durante circunstâncias lipolítica5.
A proteína DGAT1 está localizada na membrana do retículo endoplasmático (er) e desempenha um papel crucial na formação de LD no epitélio intestinal. As mutações homozygous em DGAT1 conduzem à diarreia severa do cedo-início e/ou vomiting, hypoalbuminemia, e/ou (fatal) enteropatia proteína-perdedor com falha intestinal em cima da entrada gorda, ilustrando a importância de DGAT1 na homeostase do lipido do ser humano epitélio intestinal6,7,8,9,10. Desde que a ocorrência da deficiência DGAT1 nos seres humanos é rara, o acesso às pilhas paciente-derivadas preliminares foi escasso. Além disso, a cultura a longo prazo de pilhas epithelial intestinais tem sido restringida por muito tempo às linhas de pilha tumor-derivadas que representam a fisiologia normal somente a uma extensão limitada. Conseqüentemente, a formação DGAT1-negociada do LD tem sido estudada na maior parte nos fibroblastoou nas linhasde pilha animal-derivadas7,10,11,12. Como tal, mostrou-se recentemente que os fibroblastos pacientes-derivados DGAT1-deficientes acumulam menos LDs comparados às pilhas de controle saudáveis após a estimulação com ácido oleico (OA)8.
Previamente, os protocolos foram estabelecidos às pilhas de haste epithelial da cultura de todo o órgão gastrintestinal a forma dos organóides tridimensionais (3D)13. Estes organóides intestinais podem ser mantidos na cultura por um longo período de tempo13, e permitem o estudo funcional de características epithelial local-específicas paciente-e intestinal14. Eles são geneticamente e fenotipicamente estáveis e podem ser armazenados, permitindo a expansão a longo prazo e para13.
Nós demonstramos recentemente que a formação do LD pode prontamente ser medida em organóides intestinais humanos em um ensaio da formação LD (ldf)6. Quando expostos à OA por 16 h, os organóides geram LDs para proteger as células da toxicidade induzida por lipídios. Quando as concentrações de OA são muito elevadas, as células morrem por apoptose mediada por caspase6. O ensaio de ldf foi mostrado previamente para ser pela maior parte dependente em DGAT1 como indicado por organóides derivados dos pacientes do DGAT1-mutante e pelo uso de inibidores DGAT1-specific6.
Para o ensaio LDF descrito detalhadamente aqui, os organóides 3D são cultivados a partir de biópsias intestinais e são passados semanalmente por rompimento em células únicas que formam facilmente novos organóides. Para executar o ensaio LDF, ~ 7.500 células únicas derivadas de organóides são chapeadas em cada poço de uma placa de 24 poços. Organóides são formados ao longo de vários dias, incubadas durante a noite com 1 mM OA e corados com LD540, um corante fluorescente de células permeável LD-específico que facilita a imagem. A formação de LD é então quantificada por microscopia confocal, leitora de placas fluorescentes ou citometria de fluxo.
Ao dimensionar este ensaio de formação de LD para um formato 96-well, o ensaio também pode ser utilizado para a análise de alta taxa de transferência de formação de LD para a tela para novas drogas que afetam a formação de LD em culturas organóides intestinais humanas, ou para estudar (genética humana) distúrbios que afetam Metabolismo de LD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós fornecemos um protocolo para determinar a formação do LD em organóides intestinais humanos em cima da incubação com ácido oleico. Este método é baseado no corante fluorescente específico LD LD54018, que permite a caracterização e quantificação do volume total de gotas lipídicas dentro de uma cultura organoide. Os procedimentos para estabelecer e manter culturas organoid intestinais humanas foram publicados antes de13, e um guia visual deste protocol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a B. Spee por generosamente fornecer LD540. Este trabalho foi apoiado por uma organização dos Países Baixos para a concessão da pesquisa científica (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) para S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
Referências
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