由于义务厌氧生物在氧气暴露后无法生长,使用厌氧培养技术是必不可少的。在这里,我们演示了一种简单而有效的方法,从沼气厂到气体和挥发性脂肪酸定量,培养从沼气厂衍生的混合培养物。
与有氧生物相比,严格的厌氧微生物需要缺氧,通常氧化还原潜力较低,才能促进生长。由于氧气在空气中无处不在,在种植的所有步骤中保持O 2-无条件具有挑战性,但也是厌氧培养的先决条件。这里提出的协议演示了使用简单且廉价的方法成功培育了从沼气厂衍生的厌氧混合培养物。给出了整个缺氧培养过程的精确描述,包括培养剂制备、灌装培养瓶、补充氧化还原指示器和还原剂以提供低氧化还原电位,以及交换头部空间以保持不含氧气的介质。此外,还详细介绍了无菌接种气体紧固血清瓶(通过使用无菌注射器和针头)和适当的孵育条件。本议定书还涉及气体和液体取样,以便随后分别使用气相色谱法(GC)和高性能液相色谱(HPLC)对气体成分和挥发性脂肪酸浓度进行分析,以及考虑到理想的气体定律,计算沼气和甲烷产量。
在地球上,分子氧在与大气直接接触或存在氧光营养器的区域有显著浓度。缺氧的环境称为厌氧。然而,在厌氧条件下,通过两种不同的代谢过程,发酵和厌氧呼吸1,能量转换仍然是可能的。
当进行有氧呼吸的生物体使用氧气作为终端电子接受器时,厌氧呼吸需要硝酸盐或硫酸盐2等替代电子接受器。在所谓的”电子塔”中,氧化还原夫妇根据其氧化还原电位进行组织,其中最负的在顶部(电子捐赠者),最强的氧化剂在底部具有正氧化电位(电子接受器)。捐赠者和接受者之间的电子转移通过所谓的呼吸链导致节能,电子接受者可以在塔的不同楼层捕获电子-留在图片中。因此,电子通过电子塔的下降幅度越高,通过各自反应可以保存的能量就越多。因此,在厌氧生境中也可以呼吸,例如,使用氧化还原对,包括 NO 3–/NO2–、富马酸/琥珀酸、SO32-/H2S、S/H2S、Mn(IV)/Mn(II),Fe(III)/Fe(II)2,3。首先,产生的能量作为膜电位保存,随后由电子传输磷酸化用于腺苷-三磷酸(ATP)合成膜结合的ATP合成。与有氧呼吸相比,厌氧呼吸可以节省的能量量;然而,大多数厌氧呼吸的能量输出仍然高于发酵,在缺乏氧气的栖息地的厌氧能量保护路径和其他终端电子接受器2。
在发酵过程中,富含能量的有机基质降解为各种发酵产物,这些产品通常定义整个工艺的名称,例如酒精发酵。与呼吸过程相比,发酵过程中的ATP生成仅限于基质水平磷酸化,在此期间,磷酸盐组从富含能量的磷酸基板2转移到腺苷-二磷酸(ADP)。发酵微生物在有机物的厌氧降解中起着核心作用,因为它们是基质分解的关键参与者。初级发酵产物,如有机酸、醇、CO2和H2,随后可用于二次发酵微生物生产醋酸、CO2和H2。发酵产品的示例包括乳酸、各种挥发性脂肪酸(碱酸、醋酸、丙酸、丁酸、瓦列克酸)、n-丁醇、2、3-丁二醇、丙酮和乙醇。
与有氧生物的培养相比,在严格厌氧条件下培养微生物需要完全不同的方法和设备。虽然耐氧生物经常在琼脂菜上栽培,即所谓的表面培养物,但除了少数例外,对于严格厌氧微生物来说,这几乎是不可能的。因此,严格厌氧微生物的富集培养主要建立在液体介质中,使用密封的气密隔膜的培养容器,确保无氧头空间气氛4,6,7.
目前的协议描述将为来自厌氧沼气厂的混合种群的目标微生物提供适当的培养方法。纯文化的孤立和培养更具挑战性,但不是这项工作的一部分。
在这里,我们展示了培养厌氧微生物群落的程序,基于一项关于在厌氧消化蛋白基质8期间苯基酸形成的研究。微生物群落由来自厌氧消化所有四个阶段的成员组成:水解、酸生成、乙酰乙酸生成和甲氧生成。应用了一种矿物盐介质,辅以碳源、氧化还原指标、维生素和微量元素溶液,以及还原剂。该介质用各自的蛋白性苯基酸前体基质8进行了修正。
培养厌氧微生物的最重要和最关键的步骤是确保培养介质和瓶头空间的无氧条件。像resazurin这样的指示器可用于间接检查烧瓶的正确厌氧填充。Resazurin是一种常用的氧化还原染料,因为它价格低廉,无毒,在低剂量和短孵育时间12中已经有效。当被纳入介质时,蓝色resazurin首先经历一个不可逆转的还原步骤,以resorufin,这是粉红色的中性pH值。当介质被加热13时,可能会出现这种第一反应。随后,在可逆的二次反应中,雷苏鲁丁被降为无色二氢反苏鲁丁(图7)12。在约Eh = -110 mV的标准氧化还原电位下,再红二越林/二氢再红还原剂系统变得完全无色,在-51 mV 13的氧化电位上变成粉红色。
为了进一步降低氧化还原电位,例如,为了促进已知需要低于-200 mV14的甲烷微生物的生长,可以添加Na2S溶液。或者,通常使用半胱氨酸-HCl、硫化钠或二硫磷酸钠。但是,哪种还原剂适合使用取决于相应的实验设置,可能需要特别注意。例如,硫化钠需要温度激活(例如,通过高压灭菌)。
一个平衡平衡的微生物联合体,由各种细菌和古生物属组成,一个高效工作的厌氧降解级联可以通过通过气体确定培养瓶中的头空间气体组成来进一步评估相 色 谱 法。当处理从不同前体衍生的苯基酸等化合物时,头部空间的评估是检查甲氧生成过程的快速方法8。在潜伏期结束时,在控制中,头空间CH4浓度约为50-60%,表明在厌氧条件下成功利用了应用的营养物质,从而实现了有机物质的矿化。在消化过程中,理论上的甲烷产量和可预期甲烷浓度可以在对基材进行初步分析或估算基板含量后,根据Buswell-Boyle方程确定。基质中的碳水化合物、蛋白质和脂肪。根据VDI 4630 15,碳水化合物可以导致理论上沼气生产750 Lkg-1 VSS(50%CH4和50%CO2),蛋白质到800 L kg-1 VSS(72% CH4和 28 % CO2),脂肪达到 1,390 L kg-1VSS (60% CH4和 40% CO2)
此外,还监测了VFA和苯基酸的形成和随后可能的降解。通过分析不同时间点的VFA浓度(例如醋酸盐、丙酸酯),可以评估降解过程。醋酸和/或丙酸等短链脂肪酸的积累可能指向甲氧乙酯群落成分的干扰和反应堆的整体过载。然而,一个平衡的微生物降解级联甚至可以应付非常高的VFA和醋酸浓度9。此外,醋酸酯/丙酸比可能进一步提供有关整个反应器条件16的信息。然而,有许多参数适合过程监测,必须根据拟议的实验假设来选择。在本示例中,目标变量为苯基酸浓度(图6)。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由奥地利科学基金(FWF)资助:项目编号P29360和P29143。出版工作得到了因斯布鲁克大学人民出版社的支持。我们非常重视EIG。
culture flasks (120 mL, N20) | Ochs, Germany | 102046 | |
buty rubber septa (N20) | Ochs, Germany | 102049 | |
aluminium caps (N20) | Ochs, Germany | 102050 | |
N2 gas | Messer, Austria | purity 5.0 | |
syringes + cannulae | various | ||
crimper | Ochs, Germany | 102051 | |
de-crimper | Ochs, Germany | 102052 | |
GC2010 | Shimadzu | ||
Shin-carbon GC column | Restek | chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2 | |
HPLC Prominence | Shimadzu | ||
Fast Fruit HPLC Column | Phenomenex | chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc. |