Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario
Summary
Este objetivo de este protocolo es producir axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides derivadas del tejido donante mutado Cas9 utilizando técnicas de injerto de tejido embrionario.
Abstract
Un creciente conjunto de técnicas y recursos genéticos permite a los investigadores sondear los orígenes moleculares de la capacidad de algunas especies de salamandras, como los axolotls, para regenerar extremidades enteras como adultos. Aquí, delineamos las técnicas utilizadas para generar axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides mutagenizadas cas9 que se pueden utilizar para explorar la función génica y la fidelidad de la regeneración de las extremidades. Combinamos varias técnicas embrionarias y genéticas, incluyendo la generación de haploides a través de activación in vitro, mutagénesis CRISPR/Cas9 e injerto de tejido en un solo protocolo para producir un sistema único para el cribado genético haploide en un organismo modelo de regeneración. Esta estrategia reduce el número de animales, el espacio y el tiempo necesario para el análisis funcional de genes en la regeneración de extremidades. Esto también permite la investigación de funciones específicas de regeneración de genes que pueden ser necesarias para otros procesos esenciales, como la organogénesis, la morfogénesis tisular y otros procesos embrionarios esenciales. El método descrito aquí es una plataforma única para llevar a cabo análisis genéticos haploides en un sistema modelo de vertebrados.
Introduction
Históricamente, el injerto de tejido embrionario en anfibios ha sido una técnica importante para explorar los mecanismos fundamentales de la biología del desarrollo y la regeneración. El axolotl, una especie de salamandra, posee una impresionante capacidad para regenerar tejidos y estructuras complejas como extremidades y órganos después de una lesión o amputación. Del mismo modo, pueden recibir, sin rechazo, injertos de tejido de otros individuos en etapas embrionarias, juveniles y adultas1,2,3. Las regiones de embriones que producen estructuras enteras como extremidades, colas, ojos y cabezas, y tejidos más específicos, como neuroectoderm y somitas, pueden ser injertadas entre embriones para producir animales quiméricos1,2,4,5,6. Durante casi un siglo, los estudios de estos animales quiméricos han proporcionado información crucial sobre la regeneración, diferenciación de tejidos, control de tamaño, y el patrón1,7,8.
En la última década, numerosos estudios transcripcionales de tejidos regeneradores han producido información sobre los programas genéticos subyacentes a la regeneración de salamandras9,10,11,12,13. Estos estudios se han sumado a una lista en expansión de genes candidatos que, hasta la fecha, no se caracterizan en gran medida en el contexto de la regeneración. Las técnicas de mutagénesis dirigidas, como CRISPR/Cas, ahora permiten la investigación de estos genes, y tales enfoques genéticosse ven muy facilitados por la reciente secuenciación y montaje del gran genoma del axololo1,15,16.
Buscamos desarrollar técnicas que combinaran la biología clásica del desarrollo con la nueva tecnología genética con el propósito de disuadar los mecanismos de regeneración. Durante décadas17se han establecido métodos para generar embriones haploides de axolotls y otras salamandras. Si bien estas técnicas se han observado durante mucho tiempo como ventajas de las salamandras como organismos modelo genéticos18, pocos estudios genéticos posteriores han incorporado animales haploides. Utilizamos la activación in vitro en el axolotl para producir embriones haploides que sirven como donantes de tejido para el injerto19. Utilizando embriones portadores de marcadores genéticos fluorescentes, hemos ideado métodos fiables para generar extremidades derivadas casi en su totalidad de tejidos de donantes(Figura 1A). Mediante la combinación de estas dos técnicas, hemos evitado la letalidad embrionaria tardía asociada con la haploidy, permitiendo la producción de extremidades haploides completamente desarrolladas e injertadas(Figura 1B, Figura 1B’y Figura 2).
Mediante la realización de mutagénesis mediada por CRISPR/Cas en embriones haploides antes del injerto para crear axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes, podemos investigar la función génica específicamente en el contexto del desarrollo y la regeneración de las extremidades. Esto permite el rescate de las extremidades de fenotipos mutantes potencialmente embrionarios-letales. Mientras que la microinyección CRISPR/Cas puede generar animales altamente mutantes, estos animales son típicamente altamente mosaicos, con cierto grado de retención de alelos de tipo salvaje y una variedad de mutaciones distintas en los sitios objetivo14,20. La mutagénesis basada en CRISPR en células haploides aumenta la penetración de mutaciones de pérdida de función de alelos únicos, ya que no pueden enmascararse con alelos de tipo salvaje retenidos. Por esta razón, el cribado basado en CRISPR en líneas celulares haploides se utiliza cada vez más para investigar la base genética de muchos procesos celulares21,22,23. Mediante la combinación de trazas de linaje basadas en CRISPR con nuestros protocolos de injerto de cogollos de extremidades haploides, el enfoque descrito aquí puede servir como una plataforma para pantallas genéticas haploides en animales vivos20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay algunos pasos críticos en nuestro protocolo para generar quimeras haploide-diploides que el técnico operativo debe considerar para obtener resultados consistentes de injerto.
La razón más probable para que la generación de haploides falle es debido a las malas condiciones de activación in vitro. Se deben utilizar las cantidades adecuadas de espermatozoides móviles para activar los óvulos. Para prolongar la motilidad, las muestras de espermatozoides deben mantenerse siempre a 4 oC. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Katherine Roberts por su cuidado de la colonia de axolotl. La financiación de este trabajo fue proporcionada por el Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 y 15-RMB-YALE-01) y el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Beca F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
Referências
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