הדור של כימאריק אקאוללס עם הגפיים הספאוזהות באמצעות השתלה עובריים
Summary
מטרה זו של פרוטוקול זה היא לייצר כימאריק axo, עם פלואידי forelimbs נגזר מרקמת תורם Cas9-מוטוניים באמצעות שיטות השתלת רקמות עובריים.
Abstract
קבוצה ההולכת וגדלה של טכניקות גנטיות ומשאבים מאפשרים לחוקרים לחקור את המקורות המולקולריים של היכולת של מינים מסוימים של סלמנדרות, כגון axo ls, לחדש את הגפיים כולו כמבוגרים. כאן, אנו טכניקות המתאר המשמש כדי ליצור כימאריק axo, עם Cas9-מוטאואיד פלואידי שניתן להשתמש בהם לחקר תפקוד גנים ונאמנות של התחדשות הגפיים. אנו משלבים מספר טכניקות embryological וגנטיות, כולל הדור פלואידי באמצעות הפעלת חוץ גופית, crispr/Cas9 מוטארסיס, והשתלת רקמות לפרוטוקול אחד כדי לייצר מערכת ייחודית עבור ההקרנה גנטית הפלואיד באורגניזם מודל של התחדשות. אסטרטגיה זו מקטינה את מספר בעלי חיים, מרחב, וזמן הנדרש ניתוח פונקציונלי של גנים התחדשות גפיים. זה גם מאפשר את החקירה של פונקציות ספציפיות להתחדשות של גנים שעשויים להידרש לתהליכים חיוניים אחרים, כגון אורגאוגנזה, רקמה מורפולגנזה, ותהליכים עובריים חיוניים אחרים. השיטה המתוארת כאן היא פלטפורמה ייחודית לניהול ההקרנה הגנטית של הפלואיד במערכת מודל בעלי חוליות.
Introduction
מבחינה היסטורית, השתלת רקמות עובריים בדו-חיים הייתה טכניקה חשובה לחקר מנגנונים בסיסיים של ביולוגיה והתחדשות התפתחותית. האקנוספל, זן של סלמנדרה, בעל יכולת מרשימה להתחדש רקמות ומבנים מורכבים כגון גפיים ואיברים לאחר פציעה או קטיעה. כמו כן, הם יכולים לקבל, ללא דחייה, שתלי רקמות מאנשים אחרים בשלבי עובריים, קטינים ובוגרים1,2,3. מחוזות עוברים המייצרים מבנים שלמים כגון גפיים, זנבות, עיניים וראשים, ורקמות ספציפיות יותר, כגון neuroectoderm ומסוענים, ניתן ליצור מושתל בין העוברים כדי לייצר בעלי חיים כימריים1,2,4,5,6. במשך כמעט מאה, מחקרים של בעלי חיים כאלה בצ סיפקו תובנות מכרעת להתחדשות, רקמת בידול, גודל בקרת, והפרנינג1,7,8.
במהלך העשור האחרון, מחקרים מאוד מעבר להתחדשות רקמות הפיקו תובנות לתוכניות גנטיות בבסיס סלמנדרה התחדשות9,10,11,12,13. מחקרים אלה הוסיפו לרשימה המתרחבת של גנים מועמדים אשר, עד כה, אינם מאופיינים במידה רבה בהקשר של התחדשות. טכניקות ממוקדות של מוטאוזיס, כגון crispr/Cas, עכשיו לאפשר את החקירה של גנים כאלה, וגישות גנטיות כאלה מאוד הקלה על ידי ברצף האחרונות והרכבה של הגנום axol גדול14,15,16.
ביקשו לפתח טכניקות שיחד עם הביולוגיה ההתפתחותית הקלאסית עם טכנולוגיה גנטית חדשה למטרת ניתוח מנגנוני ההתחדשות. שיטות ליצירת עוברי הפלואיד וסלמנדרות אחרים הוקמו במשךעשרותשנים. בעוד טכניקות אלה כבר זמן רב ציין להיות יתרונות של סלמנדרות כמו אורגניזמים מודל גנטי18, כמה מחקרים גנטיים עוקבות שילבו חיות פלואידי. אנו משתמשים בפעילות חוץ גופית באקסון כדי לייצר עוברי החדואיד המשמשים כתורמי רקמות להשתלת19. באמצעות עוברים הנושאים סמנים גנטיים פלורסנט, המציאו שיטות אמינות ליצירת איברים הנגזרים כמעט לחלוטין מרקמותהתורמים(איור 1א). על-ידי שילוב שתי הטכניקות הללו, נעלנו את הטבליות העובריים המאוחרת הקשורות להפלואידיות, ומאפשרת ייצור של איברים מפותחים לחלוטין, מושתלים הפלודואיד (איור 1ב’, איור 1ב’, איור 2).
על-ידי ביצוע CRISPR/Cas-תיווך מוטגנזה בעוברי הדואיד לפני השתלה כדי ליצור כימאריק axo, עם הגפיים מוטציה המטה, אנו עשויים לחקור את הפונקציה גנים במיוחד בהקשר של פיתוח גפיים והתחדשות. זה מאפשר הצלה של איברים של פנוטיפים מוטנטים קטלני להיות עובריים. בעוד crispr/Cas מיקרוהזרקה יכול ליצור בעלי חיים שהם מאוד מוטנטים, בעלי חיים כאלה הם בדרך כלל פסיפס מאוד, עם מידה מסוימת של החזקת אללים ומגוון של מוטציות נפרדות באתרים ייעודיים14,20. Crispr מבוססי מוטגנזה בתאי פלואידי מגביר את החדירה של אלל אובדן מוטציות בודדות של הפונקציה, כפי שהם לא יכולים להיות רעולי פנים על ידי שמור אלל קלד אלטלס. מסיבה זו, הקרנת מבוסס crispr בקווי התא הפלואיד משמש יותר ויותר לחקור את הבסיס הגנטי של תהליכים סלולריים רבים21,22,23. על ידי שילוב crispr מבוסס שושלת היוחסין עם האיבר הגוף שלנו ניצן השתלת פרוטוקולים, הגישה המתוארת כאן יכול לשמש פלטפורמה עבור מסכי גנטיות פלואידי בחיות חיים20.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול שלנו ליצירת הפלואיד-diploid שטכנאי ההפעלה צריך לשקול תוצאות השתלה עקבית.
הסיבה הסבירה ביותר עבור דור הפלואיד להיכשל היא עקב העניים בתנאי ההפעלה החוץ גופית. יש להשתמש בכמויות המתאימות של זרע המרצפת כדי להפעיל ביצים. כדי להאריך את התנועתיות, יש לשמ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
היינו רוצים להודות לקתרין רוברטס. על שטיפלה במושבה האקסון מימון עבור עבודה זו סופק על ידי הקרן החידוש של מקונטיקט חדשנות מחקר הרפואה (15RMA-ייל-09 ו 15-RMB-ייל-01) ו-יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד ופיתוח האדם (הפרט פוסט-דוקטורט מלגת F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
Referências
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Biologia do Desenvolvimento. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genética. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Biologia do Desenvolvimento. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
