En Ectopic chemokine udtryks model til afprøvning af makrofag rekruttering in vivo
Summary
For at afprøve virkningen af en kemokin på makrofag rekruttering in vivo, blev hele Mount in situ hybridisering anvendt til at detektere ektopisk ekspression af chemokin, og immun farvning blev brugt til at mærke makrofager. Live imaging blev brugt til realtids observation af makrofag migration.
Abstract
Zebrafish anvendes i vid udstrækning i grundforskning og biomedicin. Mange Zebra transgene linjer er i øjeblikket tilgængelige til at mærke forskellige typer af celler. På grund af den gennemsigtige embryonale krop af zebrafish, er det bekvemt for os at studere effekten af en chemokine på opførsel af en bestemt type celler in vivo. Her leverede vi en arbejdsgang til at undersøge funktionen af en chemokine på makrofag migration in vivo. Vi konstruerede en vævs specifik overekspression plasmid til at over ekspor IL-34 og injicerede plasmid i en-celle fase transgene fiskeembryoner, hvis makrofager var specifikt mærket af et fluorescerende protein. Vi brugte derefter hele Mount fluorescerende in situ hybridisering og immun farvning til at detektere mønsteret af chemokine ekspression og antallet eller placeringen af makrofager. De injicerede WT embryoner blev opvokset for at generere en stabil transgene linje. Endelig brugte vi konfokale Live imaging til direkte at observere makrofagopførsel i den stabile transgene fisk for at studere funktionen af Il-34 på makrofager in vivo.
Introduction
Zebrafish er en lille tropisk hård knogler ferskvandsfisk stammer fra Indien. Med hensyn til genbevaring, zebra har en lighed på 87% til den menneskelige1. Det kan give os indsigt i beslægtede emner af mennesker ved at studere gen regulering, protein funktion og celle adfærd såsom migration, proliferation et.al i zebrafish. Zebrafish embryo kan bruges til at observere udviklingen af tidlige embryoner på forskellige stadier efter inhibe ring af pigment. I mellemtiden, det tager kun tre måneder for Zebra at udvikle sig til seksuel modenhed, så Zebra kan producere hundredvis af æg hver 4 dage. Mini-størrelse, simpel avl, stærk reproduktionsevne, disse fordele gør Zebra kultur meget pladsbesparende, befordrende for storstilet kultur. Den traditionelle pattedyr model mus har en højere vedligeholdelsesomkostninger end zebrafish, derfor begrænser omfanget af musen hæve. I det aspekt af tidlig embryo udvikling, mus embryo er vanskeligt at observere i levende tilstand på grund af de særlige kendetegn ved mus embryo udvikling i moder livmoderen. Tværtimod udvikler Zebra embryoner eksternt og er gennemsigtige, og derfor er de lette at observere under et mikroskop. Desuden er Zebra meget let at konstruere en række transgene linjer til relateret gen funktion forskning. I øjeblikket er forskellige Zebra transgene linjer tilgængelige til at mærke forskellige typer af celler. Det er meget bekvemt nu at konstruere transgene linjer til overekspressen kemokiner i bestemte steder og studere kemokiner funktion på celle adfærd i zebrafish.
Her leverede vi en arbejdsgang til at bruge Zebra transgene line til at undersøge funktionen af Il-34 på makrofag adfærd i vivo2,3,4,5,6,7. For det første byggede vi en lever-specifik overekspression plasmid af genet il34 og injicerede plasmid i en-celle Stage TG (MPEG1: gfp) fiskeembryoner, som specifikt mærkede makrofager ved fluorescerende protein gfp. Derefter brugte vi hele Mount fluorescerende in situ hybridisering og immun farvning til at detektere mønsteret af il34 udtryk og antallet eller placeringen af makrofager. De injicerede WT embryoner blev opvokset for at generere en stabil transgene linje. I disse trin etablerede og validerede vi den cytokinproducerende linje og vurderede visuelt de virkninger, der kan ses på makrofag distributionen. Endelig, for at undersøge makrofag adfærd som reaktion på cytokin, vi brugte konfokale Live imaging til direkte observere makrofag migration for at bekræfte funktionen af il34 på makrofag migration in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, giver os mulighed for at undersøge funktionen af en chemokine på opførsel af macrophagein vivo og proceduren kræver nogle tekniske ekspertise. Sammenfattende er der flere kritiske skridt for at undgå komplikationer i protokollen: 1) Vælg en egnet transgene linje, der viser specifikke og stærke transgene signal til at mærke cellen af interesse; 2) Vælg et passende væv, der er tilgængeligt for billeddannelse og transgene gen overekspression; 3) lav en følsom og specifik RNA-s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jingrong Peng for deling af TG (fabp10a: DsRed) transgene line; Dr. Zilong Wen for deling af TG (MPEG1: GFP) transgene linjer; Dr. Koichi Kawakami for at levere den pTol2 vektor. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (31771594), Guangdong videnskab og teknologi plan projekter (2019A030317001) og de grundlæggende forskningsmidler til de centrale universiteter (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
Referências
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
