Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.
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Artigo de método
Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa básica e biomédica. Muitas linhas transgênicas de zebrafish estão atualmente disponíveis para rotular vários tipos de células. Devido ao corpo embrionário transparente de zebrafish, é conveniente para nós estudar o efeito de uma quimiocina sobre o comportamento de um determinado tipo de células in vivo. Aqui nós fornecemos um fluxo de trabalho para investigar a função de uma quimiocina na migração de macrófago in vivo. Nós construímos um plasmídeo tecido-específico do superexpressão para sobre-expressão Il-34 e injetamos o plasmídeo em embriões transgênicas da fase da um-pilha dos peixes cujos os macrófagos foram etiquetados especificamente por uma proteína fluorescente. Nós usamos então a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão do quimiocina e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Por fim, utilizou-se a imagem latente ao vivo confocal para observar diretamente o comportamento dos macrófagos no peixe transgênico estável para estudar a função da IL-34 sobre o macrófago in vivo.
Introdução
O zebrafish é um pequeno peixe tropical de água doce de ossos duros originado na Índia. A respeito da conservação genética, o zebrafish tem uma similaridade de 87% ao ser humano1. Pode fornecer-nos introspecções em assuntos relacionados do ser humano estudando o Regulamento do gene, a função da proteína e o comportamento da pilha tais como a migração, proliferação et.al no zebrafish. O embrião de zebrafish pode ser usado para observar o desenvolvimento de embriões adiantados em estágios diferentes após ter inibindo o pigmento. Enquanto isso, leva apenas três meses para que o zebrafish se desenvolva em maturidade sexual, então o zebrafish pode p....
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Protocolo
Nota: Todas as amostras foram tratadas pela água do ovo de phenylthiourea (PTU) para inibir o pigmento.
1. geração de TG (fabp10a: il34) construções transgênicas e injeção de peixe
- Clone o 2,8 KB fabp10a promotor8 e as regiões de codificação Il-34 (ensdart 00000126460.3) de zebrafish no vetor pTol2 para gerar a construção fabp10a-il34. Injete os constructos em um estádio de células TG (MPEG1: GFP) e em embriões de peixes WT juntamente com a peptídeo mRNA. Levante os embriões injetados fabp10a-il34 do WT ao adulto9 e identi....
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Resultados
As etapas envolvidas no protocolo de zebrafish são ilustradas na Figura 2. Em primeiro lugar, geramos o construto pBLK-fabp10a-il34-SV40 no qual il34 foi conduzido pelo promotor fabp10a (Figura 2). O construto foi microinjetado em embriões de zebrafish de fase TG (MPEG1: GFP) de uma célula que pode rotular macrófagos com embriões de GFP e WT que foram levantados para adultos para gerar linha es.......
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Discussão
O protocolo descrito aqui nos permite investigar a função de uma quimiocina sobre o comportamento do macróagein vivo e o procedimento requer algum conhecimento técnico. Em síntese, existem várias etapas críticas para evitar complicações no protocolo: 1) selecionar uma linha transgênica adequada que mostre um sinal transgênico específico e forte para rotular a célula de interesse; 2) selecionar um tecido apropriado que seja acessível para a imagem latente e o overexpression do gene transgênicas; 3) faça uma ponta de prova.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Jingrong Peng por compartilhar a linha transgênica TG (fabp10a: DsRed) ; Dr. Zilong Wen por compartilhar as linhas transgênicas TG (MPEG1: GFP) ; Dr. Koichi Kawakami para fornecer o vetor pTol2. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (31771594), Guangdong ciência e tecnologia projetos plano (2019A030317001) e os fundos de investigação fundamentais para as universidades centrais (D2191450).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo | |||
| Alexa 488-Anti-Goat anticorpo | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenina-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| anticorpo anti-GFP de cabra | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Reagente de amplificação | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solução | 15 mM NaCl +0,5 mM KCl +1,0 mM MgSO4+150 µ M KH2PO4 + 50 µ M Na2HPO4 +1,0 mM CaCl2 + 0,7 mM NaHCO3 | ||
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Life | 10099-133 | |
| Formamida | Diamante | A100314 | |
| Glicerol | Sigma | V900860 | |
| Heparina sódica | Sigma | H3149 | |
| Tampão de hibridização (HB) | 50% formamida + 5 vezes; SSC+9 mM de citrato de sódio+50 μ g/ml de heparina sódica+ 500 μ g/mL tRNA+ 0,1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Agarose de baixo ponto de fusão | Sigma | A9414 | |
| Metanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| Azul de metileno | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Paraformaldeído (PFA) | Sigma | 158127 | Suspender 16 g de PFA em 400 ml de 1x PBS, aquecer a 60 &graus; C para dissolver cerca de 30 min. Esta solução pode ser preparada com antecedência e armazenada a -4 °C. Atenção. Manipular com máscara. |
| 10 vezes; PBS | 14,2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2,4 g KH2PO4 em 1L ddH2O | ||
| Feniltioureia (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1× Plus Diluente de Amplificação | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20× Citrato de sódio salino (SSC) | 175,3 g NaCl + 88,2 g de citrato de sódio em 1 L ddH2O, PH 7,0 | ||
| Citrato de sódio | Sigma | A5040 | |
| Tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | Para Tg (fab10a:il34) geração de linha transgênica | ||
| pBSK-il34 | Para preparação de sonda il34 | ||
| Peixe | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Marcação de macrófagos com GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Marcação de células hepáticas com DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Hiperexpressão de IL-34 em células hepáticas |
Referências
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the....
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Reimpressões e permissões
