במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים
Summary
Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.
Abstract
J-תחום חלבונים (jdps) הטופס הגדול ביותר משפחת שותף מגוון ביותר בתאי איקריוטית. הממצאים האחרונים מראים כי חברים ספציפיים של משפחת JDP יכול ליצור הטרוקומפלקסי ארעי ב eukaryotes כדי לכוונן בחירת המצע עבור 70 kDa חום בהלם חלבון (Hsp70) חלבון מבוסס הסוכר disצוברי. JDP מתחמי מטרה חריפה/כרונית לחץ המושרה חלבונים מצטברים וכנראה לעזור להרכיב את disצוברי ידי גיוס Hsp70s מרובים על פני משטח של אגרגטים חלבון. היקף השליטה באיכות החלבון (PQC) שנוצר על ידי האינטראקציה הפיזית האלה של JDPs שרידים במידה רבה לא מאופיין בvivo. כאן, אנו מתארים מיקרוסקופ מבוסס על באתרו האינטראקציה חלבון בתוך שיטת הקשר הקרבה הקירבה (PLA), אשר מסוגל מכבש ללכוד מתחמי המלווה האלה בנויים בתאים סלולריים ברורים של תאים איקריוטית. העבודה שלנו מרחיבה את התעסוקה של PLA מן התאים האנושיים כדי שמרים (שאיפהcerevisiae ס) וחיידקים (esהמאביקcoli), ובכך עיבוד כלי חשוב כדי לפקח על הדינמיקה של מכלולים בעלי החלבון שנוצרו בשני תאים prokaryotic ו איקריוטית.
Introduction
כמות עצומה של מידע גנומי נשאר שולחן בלתי מתרגם בשל ההבנה השלמה שלנו של interactomes סלולריים. מתודולוגיות לגילוי חלבון בחלבון קונבנציונאלי, כגון חלבון co-immunoprecipitation עם/ללא קישור כימי ושיתוף לוקליזציה של חלבונים, אף שימוש נרחב, מהווים מגוון חסרונות. חלק מהחסרונות העיקריים כוללים קוונפיקציה ירודים של האינטראקציות והמבוא הפוטנציאלי של אירועי איגוד שאינם מקומיים. לעומת זאת, טכניקות מבוססות-קירבה מספקות חלופה וגישה רבת עוצמה ללכידת אינטראקציות חלבונים בתאים. שיטת החיבור (PLA)1, הזמינה כעת כערכה קניינית, מעסיקה נוגדנים למטרות במיוחד של מכלולי חלבונים המבוססים על הסמיכות של יחידות המשנה של האינטראקציה.
PLA הוא יזם על ידי היווצרות של פיגום המורכב של נוגדנים הראשי והמשני עם תגי DNA קטן (משחק משחק) על פני השטח של קומפלקס חלבון ממוקד (איור 1, שלבים 1-3). לאחר מכן, נקבע על ידי הקרבה של תגי ה-DNA, מולקולת DNA מעגלית נוצרת באמצעות הכלאה עם מחבר olig, מחברים (איור 1, שלב 4). היווצרות ה-DNA המעגלי מושלם על ידי צעד לפני הריסוס. פיסת ה-DNA שנוצרה לאחרונה משמשת כתבנית עבור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) המבוססת על הגברה מראש של הזרם המבוסס על ידי אחד מתגי הגאות והביות. זה יוצר מולקולה חד-הורית של הקונקטאממית מחוברת למכלול החלבון דרך פיגום הנוגדן (איור 1, שלב 6). מולקולת ה-DNA הconcatic הוא דמיינו באמצעות fluorescently המסומן בתווית olig, הhybridize לרצפים ייחודיים מרובים פזורים ברחבי ה-DNA מוגבר (איור 1, שלב 7)2. אות ה-PLA שנוצר, המופיע כנקודה פלואורסצנטית (איור 1, שלב 7), מתאים למיקום של מתחם החלבון המיועד בתא. כתוצאה מכך, היכולת לזהות מתחמי חלבונים בעלי דיוק מרחבי ברמה גבוהה. הטכניקה אינה מוגבלת פשוט לכידת אינטראקציות חלבונים, אבל יכול להיות גם מנוצל כדי לזהות מולקולות יחיד או שינויי חלבון על חלבונים עם רגישות גבוהה1,2.
Hsp70 טפסים מערכת המלווה מאוד רב-תכליתי חשוב באופן מהותי לשמירה על הומאוסטזיס חלבון הסלולר על ידי השתתפות במערך של משק הבית, הקשורות למתח פונקציות. פעילות משק הבית של מערכת Hsp70 המלווה כוללים קיפול חלבון דה נובו, טרנסלוקציה חלבונים על פני קרומים סלולריים, הרכבה ופירוק של מכלולי חלבון, רגולציה של פעילות החלבון וקישור קיפול חלבון שונים/ בקרת איכות machineries3. מערכת המלווה אותו גם מקפלים מחדש/שפרש החלבונים, מונע צבירת חלבון, מקדם את פירוק חלבונים ומשתף פעולה עם הפרוטסים הסלולר לבזות מוטעית סופני/פגום חלבונים כדי להקל על תיקון הסלולר לאחר מדגיש רעלים רעילים4,5. כדי להשיג את הגיוון הפונקציונלי הזה, המלווה Hsp70 מסתמך על שיתוף המלווים שותפים של משפחת JDP ונוקלאוטיד החליפין גורמים (NEFs) זה בסדר לכוונן את השליטה Hsp70’s ATP תלויי התלות של כריכת מצע ושחרור3, . שישה מטרים יתר על כן, המלווה המשותף JDP לשחק תפקיד חיוני בבחירת מצעים עבור מערכת זו המלווה צדדי. בני משפחה זו מחולקת לשלושה כיתות (A, B ו-C) על בסיס הומולוגיה המבנית שלהם לאבטיפוס של JDP, E. coli dnaj. Class A JDPs להכיל N-טרמינל J-תחום, אשר מקיים אינטראקציה עם Hsp70, אזור עשיר גליצין-פנילאללין, אזור איגוד מצע המורכב של אזור כמו אצבע אבץ (ZFLR) ושני תחומים β-חבית, ו-C-טרמינל dimerization התחום. JDPs עם אזור N-טרמינל J-מתחם ומחוז גליצין-פנילאלנין, אבל חסר את הזפלאר, ליפול לכיתה ב’. באופן כללי, חברים בשני הכיתות הללו מעורבים בתפקודים מלווים. חברים נופלים תחת הכיתה הכוללת C, אשר מכיל JDPs כי רק לשתף את ה-J-domain4, לגייס Hsp70s לבצע מגוון של פונקציות שאינן מלווים. התפקיד החשוב של JDPs כמו הכרה מצע להחלפה “מתאמים” של מערכת Hsp70 משתקף על ידי התרחבות של בני המשפחה במהלך האבולוציה. לדוגמה, לבני אדם יש יותר מ-42 חברי JDP ברורים4. הפונקציות האלה jdps כמו monomers, הומודימרס ו/או הומו/הטרו oligomers4,5. לאחרונה, שיתוף פעולה פונקציונלי באמצעות היווצרות מורכבות ארעית בין מחלקה A (למשל, H. DNAJA2; S. cerevisiae ס Ydj1) ו-class B (למשל, H. DNAJB1; S. cerevisiae ס Sis1) איקריוטית jdps דווח כדי לקדם הכרה יעילה של אגרגטים החלבון אמורפיים ב מבחנה7,8. אלה מחלקה מעורבת jdp מתחמי ככל הנראה להרכיב על פני השטח של חלבונים צבורים כדי להקל על היווצרות Hsp70-ו Hsp70 + Hsp100 מבוססי חלבון בחוסר הסוכר7,8,9, 10. הראיות הקריטיות לתמוך הקיום של אלה בעקבות מתחמי מעורבות jdp מחלקה בתאים איקריוטית סופק עם PLA8.
PLA מועסק יותר ויותר להערכת אינטראקציות חלבונים במטתים, בעיקר בתאי יונקים. כאן, אנו מדווחים על התרחבות מוצלחת של טכניקה זו כדי לעקוב אחר מתחמי המלווה שנוצרו באופן מידי בתוך איקריוטית ו-prokaryotic אורגניזמים חד-תאיים כגון מראה שמרים S. cerevisiae ס ו חיידק E. coli. חשוב מכך, התרחבות זו מדגישה את השימוש הפוטנציאלי ב-PLA בזיהוי וניתוח של חיידקים שידביקו תאים אנושיים ובעלי חיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיתוף הimmunoprecipitation וגישות מבוססות לוקליזציה שימשו כשיטות ארוכות-עמידה לאפיון מרכיב החלבונים. הגילוי של באופן מרובה באמצעות מתחמי מלווה ספציפיים הוא אתגר גדול עם שיטות קונבנציונליות כאלה, וכתוצאה מכך, ממצאים קודמים מוגבלים במידה רבה לפרשנויות איכותיות. שיטות הimmunoprecipitation המבוססות על פירוק…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NBN נתמך על ידי מענק גיוס מיוחד של אוניברסיטת מונש הפקולטה לרפואת סיעוד ומדעי הבריאות עם מימון של ממשלת המדינה של ויקטוריה והממשלה האוסטרלית. אנו מודים Bernd בוקובזה (ZMBH, אוניברסיטת היידלברג, גרמניה) ופגע H. Kampinga (המחלקה למדעים ביו-רפואיים של תאים & מערכות, אוניברסיטת חרונינגן, הולנד) על תמיכה יסולא בפז שלהם שיתוף של ריאגנטים, הולגר לורנץ (ZMBH מתקן הדמיה, אוניברסיטת היידלברג, גרמניה) על תמיכתו במיקרוסקופיה ועיבוד תמונה, וקלייר הירסט (ARMI, אוניברסיטת מונש, אוסטרליה) לקריאה קריטית של כתב היד.
Materials
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
Referências
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
