Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Summary

Le proteine Cognate J-domain cooperano con l’accompagnatore Hsp70 per assistere in una miriade di processi biologici che vanno dal ripiegamento proteico alla degradazione. Qui, descriviamo un analisi di legatura di prossimità in situ, che consente il monitoraggio di questi macchinari chaperone tradotti transitoriamente in cellule batteriche, lieviti e umane.

Abstract

Le proteine J-domain (JDP) formano la famiglia di co-chaperone più grande e diversificata nelle cellule eucariotiche. Recenti scoperte mostrano che specifici membri della famiglia JDP potrebbero formare eterocomplessi transitori negli eucarioti per perfezionare la selezione del substrato per la proteina da shock termico da 70 kDa (Hsp70) a base di proteine a base di chaperone. I complessi JDP si rivolgono a proteine aggregate indotte da stress acuto/cronico e presumibilmente aiutano ad assemblare i disaggregas reclutando più Hsp70 sulla superficie degli aggregati proteici. L’estensione della rete di controllo della qualità delle proteine (PQC) formata da questi JDP fisicamente interagenti rimane in gran parte non caratterizzata in vivo. Qui, descriviamo un saggio di interazione delle proteine in situ basato sulla microscopia chiamato il saggio di legatura di prossimità (PLA), che è in grado di catturare in modo robusto questi complessi chaperone formati in modo transitorio in compartimenti cellulari distinti di cellule eucariotiche. Il nostro lavoro amplia l’impiego di PLA dalle cellule umane al lievito (Saccharomyces cerevisiae) e ai batteri (Escherichia coli), rendendo così uno strumento importante per monitorare la dinamica degli assiemi proteici formati transitori in entrambi i cellule procariotiche ed eucariotiche.

Introduction

Una grande quantità di informazioni genomiche rimane incomprensibile a causa della nostra comprensione incompleta degli interactomi cellulari. Le tradizionali metodologie di rilevamento dell’interazione proteina-proteina, come la co-immunoprecipitazioni proteica con/senza il collegamento incrociato chimico e la co-localizzazione delle proteine, sebbene ampiamente utilizzate, rappresentano una serie di svantaggi. Alcuni dei principali svantaggi includono una scarsa quantificazione delle interazioni e la potenziale introduzione di eventi vincolanti non nativi. In confronto, le tecniche emergenti basate sulla prossimità forniscono un approccio alternativo e potente per catturare le interazioni proteiche nelle cellule. Il saggio di legatura di prossimità (PLA)¹, ora disponibile come kit proprietario, impiega anticorpi per indirizzare specificamente i complessi proteici in base alla vicinanza delle sottounità interagenti.

Il PLA viene avviato dalla formazione di uno scaffold costituito da anticorpi primari e secondari con piccoli tag di DNA (sonde PLA) sulla superficie del complesso proteico mirato (Figura1, passaggi 1-3). Successivamente, determinata dalla vicinanza dei tag del DNA, una molecola circolare del DNA viene generata tramite ibridazione con oligonucleotidi del connettore (Figura 1, passo 4). La formazione del DNA circolare è completata da una fase di legatura del DNA. Il nuovo pezzo circolare di DNA serve come modello per la successiva reazione a catena di polimerasi (PCR) basata su cerchio rotante (RCA) innescata da uno dei tag oligonucleotidi coniugati. Questo genera una molecola di DNA concatemerica a filamento collegata al complesso proteico tramite lo scaffold degli anticorpi (Figura 1, passo 6). La molecola di DNA concatemerico viene visualizzata utilizzando oligonucleotidi etichettati fluorescentmente che si ibridano a più sequenze uniche sparse nel DNA amplificato (Figura 1, passo 7)². Il segnale PLA generato, che appare come un punto fluorescente (Figura 1, passaggio 7), corrisponde alla posizione del complesso proteico mirato nella cellula. Di conseguenza, il saggio è stato in grado di rilevare complessi proteici con elevata precisione spaziale. La tecnica non si limita a catturare semplicemente le interazioni proteiche, ma potrebbe anche essere utilizzata per rilevare singole molecole o modifiche proteiche sulle proteine con alta sensibilità^1,2.

Hsp70 forma un sistema chaperone altamente versatile fondamentalmente importante per mantenere l’omeostasi cellulare delle proteine partecipando a una serie di puli’ e funzioni associate allo stress. Le attività di pulizia del sistema chaperone Hsp70 includono il ripiegamento delle proteine de novo, la traslocazione delle proteine tra le membrane cellulari, l’assemblaggio e lo smontaggio dei complessi proteici, la regolazione dell’attività proteica e il collegamento di diverse proteine che ripiegano/ macchine di controllo qualità³. Lo stesso sistema chaperone ripiega anche proteine misfolded /unfolded, previene l’aggregazione delle proteine, favorisce la disaggregazione delle proteine e collabora con le proteasi cellulari per degradare le proteine piegate in modo errato/danneggiato terminale per facilitare la riparazione cellulare dopo stress proteotossici^4,5. Per ottenere questa diversità funzionale, lo chaperone Hsp70 si basa sulla collaborazione con co-chaperones della famiglia JDP e dei fattori di scambio nucleotide (NEF) che perfezionano il controllo allostrico dipendente dall’ATP dell’Hsp70 dell’associazione altrice e del rilascio^{3, 6}. Inoltre, i co-chaperones JDP svolgono un ruolo fondamentale nella selezione di substrati per questo versatile sistema chaperone. I membri di questa famiglia sono suddivisi in tre classi (A, B e C) in base alla loro omologia strutturale al prototipo JDP, l’E. coli DnaJ. I JDP di classe A contengono un N-terminal J-domain, che interagisce con Hsp70, una regione ricca di glicine-fenilalana, una regione di legame del substrato costituito da una regione simile a un dito di zinco (FLR) e due domini a botte z, e un dominio di dimerazione C-terminale. JDP con un N-terminal J-dominio e una regione ricca di glicine-fenilalana, ma mancando la .FLR, rientrano nella classe B. In generale, i membri di queste due classi sono coinvolti nelle funzioni di chaperoning. I membri che rientrano nella classe catchall C, che contiene JDP che condividono solo il dominio J⁴, reclutare Hsp70 per eseguire una varietà di funzioni non accompagnate. L’importante ruolo dei JDP come “adattatori” di riconoscimento substrato intercambiabile del sistema Hsp70 è riflesso da un’espansione dei membri della famiglia durante l’evoluzione. Ad esempio, gli esseri umani hanno oltre 42 membri JDP distinti⁴. Questi JDP funzionano come monomeri, omodimeri e/o oligomeri omo/etero^4,5. Recentemente, una cooperazione funzionale attraverso la formazione complessa transitoria tra la classe A (ad esempio, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) e la classe B (ad esempio, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) JDP eucarioti è stato segnalato per promuovere il riconoscimento efficiente degli aggregati di proteine amorfe in vitro^7,8. Questi complessi misti di JDP di classe mista si assemblano presumibilmente sulla superficie delle proteine aggregate per facilitare la formazione di proteinea base di Hsp70 e Hsp70-Hsp100 ¹⁰. Le prove critiche a sostegno dell’esistenza di questi complessi misti jDP di classe transitoria sono state fornite con PLA⁸.

Il PLA è sempre più impiegato nella valutazione delle interazioni proteiche nei metazoi, principalmente nelle cellule dei mammiferi. Qui, segnaliamo la riuscita espansione di questa tecnica per monitorare i complessi chaperone formati transitori in organismi unicellulari eucarioti e procariotici come il lievito in erba S. cerevisiae e il batterio E. coli. È importante sottolineare che questa espansione evidenzia il potenziale utilizzo di PLA per rilevare e analizzare i microbi che infettano le cellule umane e animali.

Protocol

1. Preparazione della cella HeLa Preparare i seguenti materiali: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.4; DMEM, integrato con 10% FCS e 1% Pen-Strep; 4% paraformaldeide in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0.0001% sterile soluzione poli-L-Lysina; 10 vetrini diagnostici; una camera umida; carta velina; e Coplin striature di diapositive. NOT:</ Per garantire un’efficienza otti…

Representative Results

I nostri precedenti studi in vitro che utilizzano proteine purificate hanno rivelato che un sottoinsieme della classe umana A e dei JDP di classe B formano complessi JDP di classe mista transitori per indirizzare in modo efficiente un’ampia gamma di proteine aggregate e possibilmente facilitare l’assemblaggio di Hsp70-based proteine disaggregases7. Abbiamo impiegato il PLA per determinare se i complessi JDP di classe mista (A-B) si verificano nelle cellule tumorali cervicali umane (HeLa). I JDp um…

Discussion

Approcci basati sulla co-immunoprecipitazioni e la co-localizzazione sono stati utilizzati come metodi di lunga data per caratterizzare gli assemblamenti proteici. L’individuazione di complessi di chaperone specifici formati in modo transitorio è una grande sfida con tali metodi convenzionali e, di conseguenza, i risultati precedenti sono in gran parte limitati a interpretazioni qualitative. Le tecniche di co-immunoprecipitazionazione basate sulla lisi a base di lisi spesso richiedono il collegamento incrociato per stab…

Materials

37% Formaldehyde	Merck	103999
Acetone	Sigma-Aldrich	32201
anti-DNAJA2 antibody	Abcam	ab157216
anti-DNAJB1 Antibody	Enzo Life Sciences	ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody	In house
anti-mCherry antibody	Abcam	ab125096
anti-Sis1 Antibody	Cosmo Bio Corp	COP-080051
anti-Ydj1 antibody	StressMarq Biosciences	SMC-150,
anti-YFP antibody	In house
Coplin slide-staining jar	Sigma-Aldrich	S5516
Diagnostic slides	Marienfeld	1216530
DMEM	Thermo-Fischer	31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange	Sigma-Aldrich	DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma-Aldrich	DUO82049
Fetal Calf Serum	Thermo-Fischer	10082147
Lysozyme	Sigma-Aldrich	62971
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fischer	15070063
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P47-07
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S7547
Triton-X100	Merck	108643
Trypsin	Thermo-Fischer	25300096
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Zymolase 100T / / Lyticase	United States Biological	Z1004