Kvantificering af coenzym A i celler og væv
Summary
Denne metode beskriver prøveforberedelse fra dyrkede celler og animalsk væv, ekstraktion og derivatisering af coenzym A i prøverne, efterfulgt af højtryksvæskekromatografi til rensning og kvantificering af det derivatiserede coenzym A ved absorbans eller fluorescens detektering.
Abstract
Ny forskning har afsløret, at den cellulære coenzym A (CoA) forsyning kan blive begrænsende med en skadelig indvirkning på vækst, metabolisme og overlevelse. Måling af cellulære CoA er en udfordring på grund af sin relativt lave overflod og den dynamiske omdannelse af gratis CoA til CoA thioesters at, til gengæld, deltage i talrige metaboliske reaktioner. En metode er beskrevet, der navigerer gennem potentielle faldgruber under prøveforberedelse til at give en analyse med et bredt lineært detekteringsområde, der er egnet til brug i mange biomedicinske laboratorier.
Introduction
Coenzym A (CoA) er en essentiel cofaktor i alle levende organismer og syntetiseres fra pantothensyre, også kaldet pantothenat (salt af Pantotensyre) eller vitamin B5. CoA er den største intracellulære bærer af organiske syrer, herunder kortkædede syrer såsom acetat og succinat, gren-kæde syrer såsom propionat og methylmalonat, langkædede fedtsyrer såsom palmitat og oleat, meget langkædede fedtsyrer såsom flerumættede fedtsyrer og xenobiotika såsom valproinsyre. Den organiske syre danner en thioester-forbindelse enzymatisk med CoA for at gøre det muligt at bruge det som substrat i over 100 reaktioner i intermediær metabolisme1. CoA-thiostere er også allosteriske regulatorer og transkriptionelle aktiverere. Det er nu værdsat2 , at den cellulære samlede COA-forsyning er reguleret3,4; således kan CoA tilgængelighed være begrænsende, og at ægthedsbeviset mangler kan være katastrofale, som eksemplificeret ved nedarvede genetiske lidelser, der påvirker CoA biosyntese5. Pantothenate kinase katalyserer det første trin i CoA-biosyntesen (figur 1) og Pantothenate kinase associeret neurodegeneration, kaldet pkan, er forårsaget af mutationer i PANK2 -genet6. CoA syntase, kodet af coasyn genet, katalyserer de sidste to trin i COA biosyntese (figur 1) og Coasy protein-associeret neurodegeneration, kaldet Copan, er forårsaget af en mutation i coasyn gen7. Både pkan og Copan er nedarvede neurodegenerative sygdomme forbundet med jernophobning i hjernen og COA mangler bagvedlig sygdoms patologier.
Cellulære niveauer af total CoA varierer blandt væv8 og total COA kan stige eller falde under en række fysiologiske, patologiske og farmakologiske tilstande. Leveren CoA stiger under brændstof skifte fra fed til fastende tilstand9, og lever COA niveauer er unormalt højt i leptin-mangel overvægtige mus10. Lever CoA falder som reaktion på kronisk ethanol indtagelse11. Hjernen CoA niveauer i Pank2 knockout musemodel er deprimeret i perinatal periode, men senere i voksen scenen hjernen COA indhold svarer til vild-type niveauer, hvilket indikerer en adaptiv COA respons under udvikling12. Manipulation af vævs COA-indhold ved transgenese eller genleveringsmetoder påvirker metaboliske og neurale funktioner13,14,15. Præklinisk udvikling af potentielle terapier for pkan eller Copan omfatter celle-eller vævs-COA-målinger som indikatorer for effekt16,17,18,19,20 . Evaluering af alle disse betingelser og deres metaboliske eller funktionelle konsekvenser kræver en kvantitativ metode til måling af det samlede ægthedsbevis.
En nøjagtig, pålidelig analyse til måling af CoA i biologiske prøver er en teknisk udfordring i mange laboratorier. Desværre er der ingen prøver til rådighed til at evaluere eller kvantificere CoA eller CoA thioesters i intakte celler, selv om analoner af naturlige CoA thioesters har været meget anvendt som mekaniske sonder i undersøgelser af CoA ester udnytter enzymer21. Omdannelsen af COA, med en fri sulfgidrile (-sh), til en COA thioester (eller omvendt) er hurtig i celler eller animalsk væv under overførsel til et andet miljø og under cellelyse. Talrige acyl-CoA-synthetaser og acyl-CoA-thioesteraser i celler formidler interkonverteringerne inden for CoA-puljen, og yderligere enzymer, der anvender CoA-thiostere som substrater, forbliver aktive i biologiske prøver, indtil de slukkes af kemiske eller fysiske Betyder. Den off-loading af acyl-grupper fra CoA til carnitin af acyl-transferaser er et eksempel inden for netværket af reaktioner, der kan ændre CoA/CoA thioester fordeling. Radioaktive røbestoffer kan bruges til at måle satserne for CoA syntese i celler. De nuværende metoder til måling af CoA-og CoA-derivater i biologiske prøver er blevet revideret22 og omfatter koblede enzymatiske spektrofotometriske analyser, højtryksvæskekromatografi og massespektrometri-baserede procedurer. Men disse metoder er ofte fokuseret på bestemte CoA molekyle arter og er blinde for variation af den samlede CoA pulje. De koblede enzymatiske analyser kræver generelt større mængder inputmateriale på grund af lav detekteringsfølsomhed og har et begrænset område af linearitet.
Vores laboratorium har udviklet en pålidelig procedure for kvantificering af total CoA i dyrkede celler og animalsk væv. Strategien omfatter hydrolyse af alle CoA thioesters at give kun gratis CoA under prøveforberedelse, snarere end at gøre en indsats for at vedligeholde og analysere hele spektret af CoA-arter. Proceduren er en samling af individuelle offentliggjorte metoder til Prøvetilberedning, ægthedsbevis, rensning og identifikation efter højtryksvæskekromatografi (HPLC) og kvantificering af det derivatiserede ægthedsbevis ved absorbans eller Fluorescens detektering23,24,25. De afgørelser om ægthedsbeviser, der er opnået ved hjælp af denne procedure, har gjort det muligt at forstå ægthedsbeviset og udvikle en terapeutisk tilgang til behandling af ægthedsbeviser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi en pålidelig, trinvis procedure for kvantificering af total CoA i celler og animalsk væv med en bred vifte af lineær detektion, der er tilgængelig i mange laboratorier, der har en HPLC med enten en absorbans eller fluorescens udgang detektor. Alternativt, massespektrometri er en fælles teknik til evaluering af CoA og CoA thioesters, men er ikke almindeligt tilgængelige på grund af omkostningerne ved instrumentering og den specialiserede viden, der kræves for udvikling af metodologi og fortolkning af …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender finansiering til sponsoreret forskning leveret af CoA Therapeutics, Inc., et datterselskab af BridgeBio LLC, de nationale institutter for sundhed Grant GM34496, og den amerikanske libanesiske syriske associerede velgørende organisationer.
Materials
| 2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |
Referências
- Abiko, Y., Greenburg, D. M. . Metabolic Pathways. 7, 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -. M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
- Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
- Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
- Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
- Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
- Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107 (2015).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
- Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
- Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871 (2012).
- Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
- Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013 (2015).
- Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
- Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399 (2018).
- Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
- Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104 (2017).
- Di Meo, I., et al. Acetyl-4′-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260 (2017).
- Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
- Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
- Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
- Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
- Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
- Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
- Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) – Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
- Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
- Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
- Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
- Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).
