Denne metode beskriver prøveforberedelse fra dyrkede celler og animalsk væv, ekstraktion og derivatisering af coenzym A i prøverne, efterfulgt af højtryksvæskekromatografi til rensning og kvantificering af det derivatiserede coenzym A ved absorbans eller fluorescens detektering.
Ny forskning har afsløret, at den cellulære coenzym A (CoA) forsyning kan blive begrænsende med en skadelig indvirkning på vækst, metabolisme og overlevelse. Måling af cellulære CoA er en udfordring på grund af sin relativt lave overflod og den dynamiske omdannelse af gratis CoA til CoA thioesters at, til gengæld, deltage i talrige metaboliske reaktioner. En metode er beskrevet, der navigerer gennem potentielle faldgruber under prøveforberedelse til at give en analyse med et bredt lineært detekteringsområde, der er egnet til brug i mange biomedicinske laboratorier.
Coenzym A (CoA) er en essentiel cofaktor i alle levende organismer og syntetiseres fra pantothensyre, også kaldet pantothenat (salt af Pantotensyre) eller vitamin B5. CoA er den største intracellulære bærer af organiske syrer, herunder kortkædede syrer såsom acetat og succinat, gren-kæde syrer såsom propionat og methylmalonat, langkædede fedtsyrer såsom palmitat og oleat, meget langkædede fedtsyrer såsom flerumættede fedtsyrer og xenobiotika såsom valproinsyre. Den organiske syre danner en thioester-forbindelse enzymatisk med CoA for at gøre det muligt at bruge det som substrat i over 100 reaktioner i intermediær metabolisme1. CoA-thiostere er også allosteriske regulatorer og transkriptionelle aktiverere. Det er nu værdsat2 , at den cellulære samlede COA-forsyning er reguleret3,4; således kan CoA tilgængelighed være begrænsende, og at ægthedsbeviset mangler kan være katastrofale, som eksemplificeret ved nedarvede genetiske lidelser, der påvirker CoA biosyntese5. Pantothenate kinase katalyserer det første trin i CoA-biosyntesen (figur 1) og Pantothenate kinase associeret neurodegeneration, kaldet pkan, er forårsaget af mutationer i PANK2 -genet6. CoA syntase, kodet af coasyn genet, katalyserer de sidste to trin i COA biosyntese (figur 1) og Coasy protein-associeret neurodegeneration, kaldet Copan, er forårsaget af en mutation i coasyn gen7. Både pkan og Copan er nedarvede neurodegenerative sygdomme forbundet med jernophobning i hjernen og COA mangler bagvedlig sygdoms patologier.
Cellulære niveauer af total CoA varierer blandt væv8 og total COA kan stige eller falde under en række fysiologiske, patologiske og farmakologiske tilstande. Leveren CoA stiger under brændstof skifte fra fed til fastende tilstand9, og lever COA niveauer er unormalt højt i leptin-mangel overvægtige mus10. Lever CoA falder som reaktion på kronisk ethanol indtagelse11. Hjernen CoA niveauer i Pank2 knockout musemodel er deprimeret i perinatal periode, men senere i voksen scenen hjernen COA indhold svarer til vild-type niveauer, hvilket indikerer en adaptiv COA respons under udvikling12. Manipulation af vævs COA-indhold ved transgenese eller genleveringsmetoder påvirker metaboliske og neurale funktioner13,14,15. Præklinisk udvikling af potentielle terapier for pkan eller Copan omfatter celle-eller vævs-COA-målinger som indikatorer for effekt16,17,18,19,20 . Evaluering af alle disse betingelser og deres metaboliske eller funktionelle konsekvenser kræver en kvantitativ metode til måling af det samlede ægthedsbevis.
En nøjagtig, pålidelig analyse til måling af CoA i biologiske prøver er en teknisk udfordring i mange laboratorier. Desværre er der ingen prøver til rådighed til at evaluere eller kvantificere CoA eller CoA thioesters i intakte celler, selv om analoner af naturlige CoA thioesters har været meget anvendt som mekaniske sonder i undersøgelser af CoA ester udnytter enzymer21. Omdannelsen af COA, med en fri sulfgidrile (-sh), til en COA thioester (eller omvendt) er hurtig i celler eller animalsk væv under overførsel til et andet miljø og under cellelyse. Talrige acyl-CoA-synthetaser og acyl-CoA-thioesteraser i celler formidler interkonverteringerne inden for CoA-puljen, og yderligere enzymer, der anvender CoA-thiostere som substrater, forbliver aktive i biologiske prøver, indtil de slukkes af kemiske eller fysiske Betyder. Den off-loading af acyl-grupper fra CoA til carnitin af acyl-transferaser er et eksempel inden for netværket af reaktioner, der kan ændre CoA/CoA thioester fordeling. Radioaktive røbestoffer kan bruges til at måle satserne for CoA syntese i celler. De nuværende metoder til måling af CoA-og CoA-derivater i biologiske prøver er blevet revideret22 og omfatter koblede enzymatiske spektrofotometriske analyser, højtryksvæskekromatografi og massespektrometri-baserede procedurer. Men disse metoder er ofte fokuseret på bestemte CoA molekyle arter og er blinde for variation af den samlede CoA pulje. De koblede enzymatiske analyser kræver generelt større mængder inputmateriale på grund af lav detekteringsfølsomhed og har et begrænset område af linearitet.
Vores laboratorium har udviklet en pålidelig procedure for kvantificering af total CoA i dyrkede celler og animalsk væv. Strategien omfatter hydrolyse af alle CoA thioesters at give kun gratis CoA under prøveforberedelse, snarere end at gøre en indsats for at vedligeholde og analysere hele spektret af CoA-arter. Proceduren er en samling af individuelle offentliggjorte metoder til Prøvetilberedning, ægthedsbevis, rensning og identifikation efter højtryksvæskekromatografi (HPLC) og kvantificering af det derivatiserede ægthedsbevis ved absorbans eller Fluorescens detektering23,24,25. De afgørelser om ægthedsbeviser, der er opnået ved hjælp af denne procedure, har gjort det muligt at forstå ægthedsbeviset og udvikle en terapeutisk tilgang til behandling af ægthedsbeviser.
Her viser vi en pålidelig, trinvis procedure for kvantificering af total CoA i celler og animalsk væv med en bred vifte af lineær detektion, der er tilgængelig i mange laboratorier, der har en HPLC med enten en absorbans eller fluorescens udgang detektor. Alternativt, massespektrometri er en fælles teknik til evaluering af CoA og CoA thioesters, men er ikke almindeligt tilgængelige på grund af omkostningerne ved instrumentering og den specialiserede viden, der kræves for udvikling af metodologi og fortolkning af …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender finansiering til sponsoreret forskning leveret af CoA Therapeutics, Inc., et datterselskab af BridgeBio LLC, de nationale institutter for sundhed Grant GM34496, og den amerikanske libanesiske syriske associerede velgørende organisationer.
2-(2-pyridyl)-ethyl silica gel SPE column | Millipore-Sigma | 54127-U | |
coenzyme A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
Gemini C18 3 μm 100 Å HPLC column | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
Omni-Tip probe tissue disrupter | Omni International | 32750H | |
Parafilm | Fisher | S37440 | |
PowerGen 125 motorized rotor stator homogenizer | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
Spin-X centrifuge tube filter | CoStar | 8161 | |
Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
Waters 2475 fluorescence detector | Waters | 2475 | |
Waters 2489 UV-Vis detector | Waters | 2489 | |
Waters e2695 separations module | Waters | e2695 |